DNA聚合酶

一、定义：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3^，-OH末端，催化核苷酸的聚合作用的酶。

二、分类：

1、以DNA为模板的DNA聚合酶：包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Klenow大片段酶、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶等。

2、依赖于RNA的DNA聚合酶：逆转录酶

三、常用的DNA聚合酶的特点：

1、共同特点：能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3^，-OH末端，催化核苷酸的聚合。

2、主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。

T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。即T7 DNA聚合酶的聚合能力最强。

四、大肠杆菌DNA聚合酶I 

1956年由Kronberg等首先从E．co1i细胞中分离出来，因此也称Kronberg酶。它具有3种活性：5’→3‘DNA聚合酶活性，5’→3‘外切酶活性和3’→5‘外切酶活性。

  （1）5’→3^，聚合酶活性： 催化单核苷酸结合到引物的3^，-OH末端，以ssDNA作模板，沿引物的3^，-OH方向按模板顺序从5^，→3’延伸。

  （2）5^， → 3^，外切酶活性：这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。

  （3）3^，→5^，外切酶活性：3'→5'外切酶活性的主要功能是校对作用

1、DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件

2、DNA聚合酶I在基因工程中的重要用途：

DNA聚合酶I在分子克隆中的主要用途是，通过DNA切口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。

切口转移指在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’→3^，核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。这就是说，当外切酶活性从缺口的5^，一侧移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3，一侧补上一个新的核苷酸，但由于Pol I不能够在3，-OH和5，-P之间形成磷酸二酯键，因此在DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用下，缺口不断向3’的方向移动。这种移动特称为切口转移在迄今已发现的所有大肠杆菌聚合酶中，唯有Pol I能够进行这种独立的链的取代反应。反应中加入标记的dNTP就可以制备探针。

五、Klenow片段

1、定义：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌蛋白酶切割后形成的一个较大片段，该片段具有聚合酶活性和3’－5‘外切酶活性，称为Klenow片段

2、Klenow fragment的性质：具有5’®3’聚合酶活性和3’®5’外切酶活性。（失去了5’®3’外切酶活性）。

3、用途：

（1）补平经限制性核酸内切酶消化DNA所形成的3’凹陷末端，包括带裂口的双链DNA的修复

（2）双链DNA 3 ’突出端的削平。 

（3）对带3‘凹陷末端的DNA分子进行末端标记

（4）在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二条链；

（5）用于Sanger双脱氧法进行DNA的序列分析

（6）用于体外突变。

六、T4 DNA聚合酶

1、 T4 DNA聚合酶的性质：

（1）来源：T4 DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。

（2）酶活性：具有两种酶催活性，即5^，--->3^，的聚合酶活性和3^，--->5^，的核酸外切酶活性。

（3）特点：

①5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性；

②在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切；

③在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；

④在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。

2、 T4 DNA聚合酶的用途

（1）切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端。

（2）DNA 3’末端标记：所用方法是取代合成法，即置换合成法。

用3’®5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’®3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。

七、其他DNA聚合酶

（一） T7 DNA聚合酶

（1）来源：从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：

① T7基因5编码的大亚基：有5’®3’聚合酶和3’®5’外切酶活性。

② 大肠杆菌编码的小亚基：增加大亚基对模板的亲和性。

（2）T7 DNA聚合酶的特点

① 持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。

②  3’®5’外切酶活性高：单链和双链都能降解。

（3）T7 DNA聚合酶的用途

① 以大分子量DNA为模板的合成

② 进行末端标记：取代合成法标记3’末端，与T4 DNA聚合酶相同。

③ 补平隐蔽末端：合成碱基补平3’隐蔽末端；水解切平3’突出末端。

（4） 修饰后的T7 DNA聚合酶：

（1）T7 DNA聚合酶的化学修饰：去除3’®5’外切酶活性（切除大亚基的一部分），使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。

（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途

① DNA测序：双脱氧法。

② 标记DNA 3’隐蔽末端。

③ 更有效地补平3’末端。

（二）TaqDNA聚合酶

是一种耐热的DNA聚合酶，具有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和5‘→3‘的核酸外切酶活性，最适温度为75～80℃，主要用于PCR反应中。

（三）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）

从病毒中分离到，具有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和RNA酶H活性，降解RNA链，主要用于以mRNA为模板合成互补DNA，建立cDNA文库。

用途：1、以RNA为模板聚合cDNA链。

2、双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。