DNA 连接酶

一、DNA连接酶的发现

      1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。这种酶需要在一条DNA链的3^，—末端具有一个游离的羟基(—OH)，和在另一条DNA链的5^，—末端具有一个磷酸基团(—P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的作用。

注意：DNA连接酶只能连接双螺旋DNA骨架上的切口，不能连接裂口及单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子或DNA-RNA杂交双链的一部分。

二、DNA连接酶的基本性质

1、修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；

2、修复与RNA链结合的DNA链上缺口的磷酸二酯键；

3、连接平头双链DNA分子。

三、DNA连接酶的种类

1、T4DNA连接酶：既可以用于粘性末端的连接又可用于平头末端的连接。

2、大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。

四、DNA连接酶的连接机理

1、ATP（NAD+）提供激活的AMP，并释放出焦磷酸PPi。

2、2、AMP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物。

3、AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。

4、AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。

5、 3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。

五、DNA连接酶的反应体系

Tris-HCl     50 - 100 mM pH 7.5

缓冲液        MgCl2        10 mM

          ATP            0.5 - 1 Mm

          DTT            5 mM

          连接酶

          DNA片段

          Volume      10 - 20 μl

          T, t         黏性末端12 - 16℃, 4 - 16 hr

                      平头末端10 - 20℃

反应的终止：加2μl 0.5mol/L的EDTA或75℃水浴10min。

从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。

提高平头末端连接效率的方法包括：

1、加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）；

2、加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会；

3、加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用。 

六、影响连接反应的因素

1、插入片段与载体的浓度比例    

一般是10~20倍，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。

2、反应温度

对于粘性末端，温度介于同源粘性末端的Tm与酶的最佳反应温度之间，一般为12～16℃。

对于平头末端，一般近似于反应中最小片段的Tm，为10～20℃之间。