基因操作包括以DNA分子的切割和连接为核心的一系列步骤，需要多种具有不同功能的工具酶参与完成。以限制性内切酶(restrictionendonuclease)和DNA连接酶(1igase)为主的多种工具酶的发现和应用，为基因操作提供了十分重要的技术基础。基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应。已经知道有许多种重要的核酸酶，例如核酸内切酶、核酸外切酶，以及用信使RNA模板合成互补链DNA的反转录酶等，在基因克隆的实验中都有着广泛的用途。

限制性核酸内切酶

一、限制性核酸内切酶的发现与定义

1968年，Meselson和Yuan最早从大肠杆菌B和    K菌株的限制和修饰系统中分离到限制性内切酶，这种酶后来被命名为I型限制性核酸内切酶。在1970年，Smith和Wilcox首先从流感嗜血菌中发现II型限制性核酸内切酶（即HindⅡ）

1、定义：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4~8bp），并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

2、来源：原核生物。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。。

3、功能：与细菌的自我保护作用有关，在细菌的限制和修饰系统（R/M体系）中起重要作用。

（1）限制：当外源DNA入侵后，限制性内切酶可将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断，将其降解掉。

（2）修饰：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。

细菌的甲基化酶很多，如：① Dam甲基化酶：可在GATC序列腺嘌呤N⁶位置引入甲基，使其发生甲基化。② Dcm甲基化酶：CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。

二、限制性核酸内切酶的类型

     目前已经鉴定出有三种不同类型的核酸内切限制酶，即I型酶、II型酶和III型酶。

1、I型限制性内切酶：

1968年，Meselson和Yuan最早从大肠杆菌B和K菌株的限制和修饰系统中分离到限制性内切酶，即EcoB和 EcoK。这种酶后来被命名为I型限制性核酸内切酶。

（1）识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列。

EcoB： TGA(N)8TGCT；EcoK：AAC(N)6GTGC（N代表任意碱基）

（2）切割位点：I型限制性内切酶虽可识别DNA分子中特定的核苷酸序列，但它们的切割作用却是随机进行的，其切割方式是，先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互结合，然后沿着DNA移动相当于1000～5000个核苷酸的一段距离后，在随机的位置上切割任意一股单链，形成大约75个核苷酸的缺口。

2、II类限制性内切酶：

首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌d型菌株中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ，随后又分离出了其他的II类限制性内切酶，如HindⅢ等。目前已有400多种II类限制性内切酶被分离，它们是分子量较小的单体蛋白，识别和切割双链DNA分子时仅需要Mg2+,识别和切割位点的序列有严格的特异性。

（1）识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（4~8bp，多数是回文序列）。与DNA的来源无关。

（2）切割位点：大部分II类酶的切割位点在识别序列内部或两侧。切开双链DNA后可形成粘性末端或平齐末端。

（3）粘性末端：含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型，即① 5’端凸出（如EcoR I切点）和② 3’端凸出（如Pst I切点）。不论哪种粘性末端，同一个酶切后产生的两个粘性末端都是互补的。

（4）粘性末端的意义：

①连接便利：不同的DNA双链只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。

② 5’末端标记：凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行³²P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。

③ 补平成平齐末端：粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。

（5）同裂酶：来源不同，识别位点的序列相同的限制性内切酶。

① 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ 和Hsu I。

② 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。

（6）同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。常用的BamH I、Bcl I、Bgl II、Xho II就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但这类位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。

3、 III类限制性内切酶：在完全固定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。不能应用于基因克隆。

三、限制性内切酶的命名：（略）

四、II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作：

1、根据酶反应所需盐离子浓度的不同，可将其分为低盐酶、中盐酶和高盐酶。

1 U 核酸内切酶：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA所需的酶量。

2、限制酶消化反应的步骤（略）。

3、限制性内切酶反应的终止：消化DNA样品后，在进一步处理DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性（如分步酶切时），钝化大多数限制性内切酶的方法有加热、加EDTA、抽提等。

4、II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：

如果有共用buffer（比如都是低盐酶等）可同时酶切，若无共用buffer，则需要分步酶切。

五、影响限制性内切酶活性的因素：

1、DNA的纯度：

污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。

为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法：

①纯化DNA；

②增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。

     ③延长酶催化反应的保温时间。

④扩大酶催化反应的体积。

 2、DNA的甲基化程度：基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

3、DNA的分子结构：DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。

4、温度：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37℃，少数要求40-65℃。

5、核酸内切酶的缓冲液性质

Star activity：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，称为Star activity现象。

如EcoR I在正常条件下识别并切割5‘-GAATTC-3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘-AATT-3’

六、使用限制酶的注意点

1、节约

2、先加其他成分，再加酶

3、酶体积不超过反应总体积的1／10

4、延长消化时间可减少酶的用量