核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链结构。

用途：1、检测特定生物有机体之间的亲缘关系；2、揭示核酸片段中某一特定基因的位置，在鉴别重     组子、分离基因、分析DNA片段及研究表达等工作     中应用广泛。

分类：Sourthern blot、Northern blot、斑点印迹杂交、原位杂交等。

步骤：1、核酸印迹的转移（电泳、变性、转印）；2、印迹与探针杂交（杂交、检测）。

一、核酸杂交的探针

（一）、定义：一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。

（二）、种类：据制备方法及核酸性质不同，可分为：寡核苷酸探针、基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针。

（三）、探针标记物：

1、放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等。

2、非放射性同位素：地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。

一个理想的标记必须符合以下条件：

（1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;

（2）特异性强、重复性好；

（3）操作简单、节时；

（4）安全、无环境污染。

二、Southern blotting

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。

（一）主要步骤：

1、待测DNA样品的制备、酶切；

2、待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳；

3、凝胶中DNA的变性：碱变性（随后用酸中和过量的碱）；

4、Southern转膜：硝酸纤维素（NC）膜、尼龙膜（方法有毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空印记法）；

5、探针的制备；

6、Southern杂交；

7、杂交结果的检测。

（二）转膜方法：

1、虹吸法：利用虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。

2、电转印法：利用电泳作用将凝胶中的DNA转移至滤膜上，是一种快速、简单、高效的转移法，只需几小时

3、真空印记法：利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转移到凝胶下面的滤膜上。 

三、Northern blotting

1979年，J.C.Alwine等人发展而来，Northern分子杂交技术由于与Southern分子杂交技术类似而得名。它们所不同的是：Northern分子杂交技术用于检测特异的RNA（主要是mRNA）分子的存在。mRNA样品经过电泳，转移到硝酸纤维素膜上，与放射性标记的RNA或DNA探针进行杂交，经过放射自显影，特异的mRNA分子在样品中的存在与否，其长度大小以及量的多寡便可得知。

四、斑点印迹杂交：

斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上（不需要电泳、转膜），然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。

五、原位杂交：

用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。

（一）原位杂交的类型：菌落原位杂交和噬菌斑原位杂交。

（二）特点：

1、能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究；

2、不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高；

3、能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。

（三）操作过程：

1、把菌落或噬菌斑转移倒NC滤膜上（同时复制在琼脂平板上，菌落位置要与膜上的一样）；

2、带有DNA印迹的滤膜与探针杂交；

3、放射自显影后与原来平板对照，挑出含目的序列的菌落或噬菌斑。