核酸的检测与保存

一、核酸的检测

紫外光谱分析法（常用于定量）、荧光分析法、凝胶电泳法（常定性）

（一）、紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量

1、前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/ml。

2、结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml。

3、紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤：

（1）吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。

（2）分光光度计先用一定量的水校正零点。

（3）测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。

（4）计算浓度：

①双链DNA样品浓度(μg/μl)= OD260×核酸稀释倍数×50/1000；

②RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数×40/1000。

（5）分析纯度。

（6）测定结果分析

①测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应约为1.8，OD260／OD230应大于2.0。

OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。

OD260/OD280小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；

OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。

②测RNA

纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。

若OD260/OD280比值小于1.7，说明有蛋白质或酚的污染；

若OD260/OD280比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；

OD260/OD230比值小于2.0时，表明有小分子及盐存在。

（二）、溴乙锭荧光法测定核酸的含量

如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。

1、原理：DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭（EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。

2、注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。

二、核酸的保存

（一）、对DNA

 DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存； 

长期保存样品可进行干燥。

（二）、对RNA

（1）RNA样品溶于0.3mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;

（2）长期保存也可以沉淀形式贮于乙醇中， -20℃保存;

（3）在RNA溶液中，加1滴0.2mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。也可溶解于100%去离子甲酰胺中，-70℃保存

注意：RNA样品不可反复冻融，否则易降解。