第二章    核酸的基本操作技术

 核酸的提取

一、 DNA的提取

DNA是生物的主要遗传物质，因而DNA的制备是基因工程的基础。由于生物形式的多样性（细菌、植物、动物），以及DNA在生物体中存在形式的差异（染色体、线性DNA、质粒），因此，制备DNA的过程和方法也不相同。

（一）、DNA在生物体中的存在形式

1、染色体DNA：是生物体遗传信息的主要载体。 

（1）原核生物染色体结构简单，储存的信息相对较少；

（2）真核生物染色体结构复杂，储存大量的遗传信息；

    （3）用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达。

    2、质粒DNA（染色体外遗传物质）

（1）特点：能自我复制，大小不一，在体内以超螺旋形式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在。

    （2）用途：构建克隆载体，分离目的基因（如分离抗性基因构建新载体等）

   3、病毒DNA：构建克隆载体，分离目的基因

   4、叶绿体和线粒体DNA

   用途：构建克隆载体，分离目的基因

（二）DNA提取的一般步骤

1、准备生物材料：

选用的材料应处于提取DNA得率最高的生长期。如：提取大肠杆菌质粒DNA，菌液应培养至对数生长后期（测定OD₆₀₀值）；提取植物DNA，最好选取幼嫩的部分。

2、裂解细胞：

对于原核生物可用溶菌酶、冰冻和超声波等法；对于结构复杂的动植物材料先粉碎，然后用液氮研磨或匀浆。

3、分离和提取DNA：

（1）总DNA，酚／氯仿等抽提；

（2）叶绿体／线粒体DNA，一般采取先提纯细胞器，再溶解细胞器膜，待释放出细胞器DNA后，再进一步提取纯化之。

（3）质粒DNA，要将其与染色体DNA分开。

（三）、细菌总DNA的制备（E.coli）

1、菌体培养:  将活化的菌体接种于LB培养基，37℃培养至对数生长期,然后置冰水浴20min。

2、收集菌体：离心（5000 g, 5 min） （50 ml）

3、菌体裂解：加5ml冷 TES（0.1 M Tris-HCl,0.1 M EDTA,0.15 M NaCl,pH 8.0，即TEN）加10 mg 溶菌酶,于37℃温育10 min。

4、去RNA：加入1 mg RNaseA，于室温温育15 min

5、去蛋白：加入0.6 ml 10% SDS和Protease K（0.1

  mg/ml），50℃，3h（或者37℃过夜），加苯酚-氯仿抽提（等体积）

6、沉淀DNA：加入1/10体积的3M的NaAc（pH5.2）, 2V无水乙醇以玻璃棒缠绕絮状沉淀,溶于TE Buffer中。

有时还需要加入CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）除去细菌多糖。其基本原理在于CTAB可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的；在低盐溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开；然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇。特点：能较好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材料最为合适;在提取前期能同时得到高质量的DNA及RNA（即也可以用于RNA的提取中）。

（三）、细菌质粒DNA的提取

常用方法为碱裂解法，当然还有其他的如煮沸裂解法、羟基磷灰石柱层析法等）。质粒提取过程中需要除去的杂质有蛋白质（可用SDS和蛋白酶变性，苯酚-氯仿抽提）、基因组DNA（调节pH从碱性降到中性)、     脂类及小分子杂质（用乙醇等沉淀）、RNA（RNase降解)。

1、原理：在强碱的作用下（溶液2中的NaOH），质粒DNA和染色体DNA会发生变性，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件恢复时（加入溶液3后，溶液3含有冰醋酸，使溶液pH值变为中性），DNA会复性，此时质粒DNA迅速复性恢复天然构型，而染色体DNA难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。而质粒DNA存在于上清液中。

2、所用的试剂作用：

溶菌酶（溶液1中，有时也不加）（G⁺菌细胞壁主要成分就是肽聚糖和磷壁酸，G^-内壁曾也含有肽聚糖）、葡萄糖（溶液1中）、EDTA（溶液1）、NaAc-HAc缓冲液（溶液3，或者用KAc）。

3、质粒的提取步骤（略）。

4、影响质粒DNA产量的因素：

（1）受体菌株：一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5a、JM109等。endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断（endA 基因的变异将使插入的外源DNA 更加稳定，有利于重组质粒的提取，提取的质粒纯度更高）。

（2）质粒拷贝数：这是直接决定DNA产量的重要因素之一。质粒本身的性质所决定：

（3）质粒大小：一般分子量大的质粒，拷贝数少。（四）、动物和植物细胞DNA的提取(略)。

二、RNA的提取

细胞中的总RNA，80%～85%是核糖体RNA，10%～15%是转运RNA及小分子RNA， 1%～5%是信使RNA（mRNA）。

提取细胞总RNA可采用异硫氰酸胍一步法或盐酸胍-有机溶剂法。异硫氰酸胍和盐酸胍是强烈的蛋白质变性剂，使蛋白质的二级结构解体，核蛋白与核酸分离，抑制内源性RNase。

RNA提取中最重要的是去除RNAase的干扰。DEPC要用去离子水配制，在Tris和其它胺类缓冲液中的半衰期很短，不能用于处理这些缓冲液。

mRNA的提取：mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。

几乎所有的mRNA3’端都具有polyA的序列，而tRNA和rRNA上都没有这样的结构。进行oligo（dT）-纤维素柱层析时，只有3’端有polyA的mRNA才与oligo（dT）结合，从而达到与其它RNA分离的目的。在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，即可得到较高纯度的mRNA。