基因工程的诞生与发展

（一）基因工程诞生的基础

基因工程诞生于1973年，它是数十年来无数科学家辛

勤劳动的成果、智慧的结晶。1973年，斯坦福大学的S．Cohen等人，成功地进行了一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌的抗四环素（TC^r）质粒PSCl01和抗新霉素（Ne^r）及抗磺胺（S^r）的质粒R6-3，在体外用限制性内切酶EcoRI切割，连接成新的重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。结果在含四环素和新霉素的平板中，选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落。这是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。基因工程从此诞生，这一年被定为基因工程诞生的元年。  

从40年代开始，科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。

概括起来，从40年代到70年代初的基因工程诞生，在现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用：

     1、理论上的三大发现：

（1）首先，40年代发现了生物的遗传物质是DNA。

（2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。 

（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸。 

（1）证明DNA是遗传物质的经典实验：

①、肺炎球菌转化实验：1928年，英国科学家Griffith 进行的该实验。他将有致病性的S型肺炎球菌（夹膜为毒力因子）注射小鼠后可引起小鼠死亡，而无致病性的R型肺炎球菌注射小鼠后不会引起小鼠死亡（不含夹膜）。加热杀死的S型肺炎球菌注射小鼠后也不会引起小鼠死亡。但将加热杀死的S型肺炎球菌与R型肺炎球菌混合后注射小鼠则引起小鼠死亡，并且从小鼠血液中分离到了活的S型肺炎球菌，这一试验表明被杀死的S型肺炎球菌使R型肺炎球菌转化为S型肺炎球菌，即无害的R型肺炎球菌从被杀死的S型肺炎球菌中获得了一些与毒力有关的某种特殊的生物分子或遗传物质（即转化因子）。但具体此因子是什么，Griffith没有证实。

这种生物分子或遗传物质是什么呢？到了1944年Avery等的研究证实该物质是DNA。他们将活的S型肺炎球菌的DNA、蛋白质、多糖等物质分别提取出来，分别与活的R型肺炎球菌混合，结果发现只有添加DNA的R型肺炎球菌可转化为S型肺炎球菌，用DNA酶消化后则失去转化能力，而用蛋白酶处理则对转化能力没有影响。说明细菌中具有转化作用的是DNA而不是其他成分。

②、T2噬菌体的感染实验

1952年，A.D.Hershey和M.Chase发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验。他们将T2噬菌体的衣壳蛋白和遗传物质DNA分别标记上35S和32P，与大肠杆菌进行混合，使噬菌体感染大肠杆菌，然后经搅拌使两者不再反应，再经离心使两者分离，上层为病毒空壳，不含DNA，下层为感染了T2噬菌体的大肠杆菌，经测定发现35S只存在于上清中，沉淀中没有，而32P则几乎全部都在下层的细菌中，而且由大肠杆菌中释放出来的子代噬菌体含有亲代的DNA，但没有检测到35S。表明DNA可由噬菌体转化进入大肠杆菌内并遗传给子代噬菌体，但蛋白质没有遗传给子代噬菌体，因此DNA在病毒和生物体复制或繁殖中的关键作用。

（2）、DNA双螺旋结构模型和半保留复制机理的发现

DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。

1953年，Walson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型。对生命科学的发展，足以和达尔文学说、盂德尔定律相提并论。 1962年，沃森、克里克与威尔金斯因研究DNA双螺旋结构模型的成果，共同荣获了诺贝尔生理学或医学奖。（1950年，当时在伦敦大学国王学院进行研究的威尔金斯利用刚刚发明的X射线衍射技术清楚地观测到了DNA的结构，是威尔金斯最先用X射线得到DNA的图像，是他让克里克和沃森认识了DNA，是他的图像启发了这两位科学家，从而提出了DNA的双螺旋模型，随后提出了DNA的半保留复制）

（3）遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。

既然DNA是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？

1961年Monod和Jacob提出了操纵子学说。以Nireberg等为代表的一批科学家，经过艰苦的努力，确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核甘酸组成一个密码子，代表一个氨基酸。到1966年全部破译了64个密码，编排了一本密码字典，叙述了中心法则，并提出遗传信息流是DNA→RNA→蛋白质。从此，千百年来神秘的遗传现象，在分子水平上得到了揭示。

遗传信息的传递方式：中心法则，1958年Crick提出，1971年又进行了补充。

2、技术上的三大发明：

（1）限制性核酸内切酶的发现和DNA的切割

（2）DNA连接酶的发现和DNA片段的连接

（3）基因工程载体的研究与应用

（1）限制性核酸内切酶的发现 

从40年代到60年代，虽然从理论上已经确立了基因工程的可能性，科学家们也为基因工程设计了一幅美好的蓝图。但是，科学家们面对着庞大的双链DNA(ds DNA)，尤其是真核生物，其DNA分子是相当巨大的，仍然是束手无策，不能把它切成单个的基因片段。尽管那时酶学知识已得到相当的发展，但没有任何一种酶能对DNA进行有效的切割。

直到1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶HindⅡ，使DNA分子的切割成为可能。1972年Boyer实验室又发现了名叫EcoRI的核酸内切酶，这种酶每遇到GAATTC序列，就会将双链DNA分子切开形成DNA片段。以后，又相继发现了大量类似于EcoRI这样的限制性核酸内切酶，这就使研究者可以获得所需的DNA特殊片段，为基因工程提供了技术基础。

（2）对基因工程技术的突破的另一发现是DNA连接酶

的发现

1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。这种酶能够参与DNA缺口的修复。1970年，美国的Khorana实验室发现了一种叫T4 DNA连接酶，具有更高的连接活性，使DNA分子进行体外连接成为可能。

     （3）基因工程载体的发现

科学家有了对DNA切割与连接的工具(酶)，还不能完成DNA体外重组的工作。因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力。

（二）基因工程的诞生

具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。两位科学的“助产士’——Berg和Cohen把基因工程接到了人间。

1972年，美国斯坦福大学的P．Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。他们使用限制性内切酶EcoRI，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和 λ 噬菌体的DNA分别进行酶切，然后再用T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来，结果获得了包含有SV40和λDNA重组的杂种DNA分子。

1973年，斯坦福大学的S．Cohen等人，也成功地进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌(E．Coli)的抗四环素(TC^r)质粒PSCl01和抗新霉索(Ne^r)的质粒R6-3，在体外用限制性内切酶EcoRI切割，连接成新的重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。结果在含四环素和新霉素的平板中，选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落，即表型为TetrKanr的菌落（命名为pSC102质粒DNA）。

S．Cohen的工作，是第一次成功的基因克隆实验,其重要意义在于：它说明了像pSC101这样的质粒分子是可以作为基因克隆的载体，能够将外源的DNA导入寄主细胞。

随后，S. Cohen与H. Boyer等人，把非洲爪蟾的核糖体基因同pSC101质粒重组后，导入大肠杆菌细胞，并转录出mRNA产物，即爪蛙的基因在细菌细胞中同样可以复制与表达，产生出与爪蛙核糖体RNA完全一样的RNA。这几个实验是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。基因工程从此诞生，这一年被定为基因工程诞生的元年。 

（三）基因工程的发展

1、基因工程的艰难阶段

作为新兴事物，不容易被接受。另外人们对其安全性问题有所担忧，如（1）选择性标记的安全性问题；（2）新型病毒的出现：制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。（3）再比如插入基因的安全性问题，插入基因有利有弊。由于目前插入基因的插入位点是随机性的，外源基因可能引起插入突变、引起某一基因失活或激活沉没基因。这些突变的表型可能很小，也可能很大，甚至致死。（4）再比如外源基因编码蛋白质的安全性，被人体应用后要考虑外源基因编码蛋白质的过敏性问题；这些都是人们普遍担忧的问题。1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。

针对这些问题，科学家也采取了一系列的措施，1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。

1975年西欧几个国家签署公约，限制基因重组的实验规模，美国也制定了相应的法规。1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。即建立了严格的DNA重组实验室设计与操作规范。1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。

2、基因工程的逐渐成熟阶段

1977年：日本科学家首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。

同年的几个月后，美国的Ullvich克隆并在大肠杆菌中表达了人的胰岛素基因。

1978年：美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序幕。1982年该产品在美国上市。

1979年美国Genentech公司成功地将人生长激素基因转入大肠杆菌中，一升培养物在7个小时内就能生成相当于60个垂体的生长激素。

1980年干扰素基因在大肠杆菌中表达成功。

1980年建立了第一个GE生产工厂。

1981年，从遗传工程菌获得的新产物有动物口蹄疫疫苗，乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原以及牛生长激素等。

1984年白细胞介素。

3、基因工程的迅速发展阶段：

20世纪80年代以后进入基因工程的迅速发展阶段，开始朝着高等动植物物种的遗传特征改良及人体基因治疗等方向发展：

（1）1982年：首次通过显微注射培育出第一个转基因动物－转基因小鼠

1983年：采用农杆菌介导法培育出第一例转基因植物－转基因烟草

1985年：PCR技术问世

1990年：美国首次批准一项人体基因治疗计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功，从而开创了分子医学的新纪元。

1991年：HGP计划讨论、出台

1997年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多莉”绵羊
   2000年，中、美、日、德、法、英 6 国科学家联合宣布成功绘制出人类基因组草图。 2001年全部完成。随后启动微生物基因组计划。