实验八 酶联免疫吸附试验
(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
【目的与要求】
1. 掌握ELISA的原理和方法。
2. 了解ELISA的基本操作。
【实验原理】
酶免疫技术是结合酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性而建立的一种免疫检测技术，包括用酶标记抗体对组织切片或其它标本中的抗原进行定位分析的酶免疫组织化学技术和用酶标记抗体（或抗原）对液体标本中的抗原（或抗体）进行定性和定量分析的酶免疫测定（EIA）。EIA通过酶分解底物产生有色物质的颜色反应，肉眼观察颜色深浅或使用酶标仪测定光密度值（OD），以反映抗原或抗体的含量。用于标记的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）等，以酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）最为常用。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA方法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三种必要的试剂：①固相的抗原或抗体 ②酶标记的抗原或抗体 ③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。主要有双抗体夹心法、间接法和竞争法等（图8-1）。
图8-1 酶联免疫吸附试验
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。本试验以测定IgE为例进行详细介绍。在支气管哮喘、荨麻疹、过敏性鼻炎等过敏性疾病及寄生虫病、何杰金病等患者的血清中，IgE浓度升高。测定时，将兔抗人IgE抗体包被在固相载体表面，加入待检血清，使待检血清中的IgE与兔抗人IgE抗体结合，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记羊抗人IgE抗体，也通过抗原抗体反应结合在固相载体上，形成兔抗人IgE－标本中的IgE－酶标记羊抗人IgE的复合物，洗去过剩的标记物，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物，酶催化底物生成有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析IgE。本实验使用的酶为辣根过氧化物酶（HRP），底物为H2O2，供氢体为邻苯二胺（OPD）。在HRP的催化下，H2O2被还原为H2O，OPD因失去氢而转变为棕色的氧化型OPD。
【材料】
1. 包被液：0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液。
2. 洗涤液：0.02 mol/L pH 7.4 PBS－吐温20。
3. 封闭液：5% BSA（牛血清白蛋白）
4. 标本稀释液：含10%小牛血清的0.01 mol/L pH 7.4 PBS－吐温20。
5. 底物稀释液：0.018 mol/L pH 4.0磷酸柠檬酸缓冲液。
6. 兔抗人IgE抗体。
7. 人IgE标准品。
8. 待检人血清。
9. HRP标记的羊抗人IgE抗体。
10. 邻苯二胺（OPD）。
11. 30％ H2O2。
12. 终止液：2 mol/L H2SO4。
13. 聚苯乙烯多孔板/条。
【方法】
1. 包被：用包被液将兔抗人IgE抗体稀释成10g/ml，在酶标板中加入100µl/孔，置37 ℃ 2h后再移至4℃过夜。
2. 洗涤：取出酶标板，弃去孔内液体，用洗涤液PBS-吐温20加满各孔，静置1min，拍干。重复3次。
3. 封闭：将5% BSA加入酶标板100µl/孔，4℃过夜。
4. 洗涤：按步骤2洗涤酶标板3次。
5. 加样：
（1）标准品：用标本稀释液将IgE标准品稀释成不同浓度的工作液，依次加入酶标板中，每孔100µl。
（2）待检血清：将待检血清作1:20稀释，加100µl/孔到酶标板中。
（3）阴性对照：加阴性对照血清100µl/孔。
（4）空白对照：加标本稀释液100µl/孔，作空白对照。
将酶标板置于湿盒，37℃孵育30min。
6. 洗涤：按步骤2洗涤酶标板3次。
7. 向各孔中加入HRP标记的羊抗人IgE抗体（其稀释度根据预实验结果而定），每孔100µl，将酶标板置于湿盒，37℃孵育30min。
8. 洗涤： 按步骤2洗涤酶标板3～4次。
9. 显色：取适量的OPD和H2O2，溶于底物稀释液（每10ml底物稀释液内加入4mg OPD和15µl H2O2）。将100µl新鲜配置的底物液加入各孔内，置于湿盒，37℃避光孵育10～15min。
10. 终止反应：向各孔中加入50µl 2mol/L H2S04。
11. 测定：用酶标仪测定各孔OD值（波长492nm）。
【实验结果】
1．空白对照及阴性对照应无色。
2．各阳性反应孔呈棕黄色，标准品各孔呈明显的颜色深浅梯度。
3．以IgE标准工作液的OD值为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线。依据待检血清所测得的OD值，从标准曲线中求出其IgE含量。
下面简单介绍一下间接法以及竞争法：
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
近年来对酶免疫分析技术进行了不断改良，建立了许多放大系统，应用亲和素和生物素的ELISA是典型代表。
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度（图8-2）。
图8-2 生物素－亲合素放大系统
【ELISA操作注意事项】
1. 加样：ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
2. 保温：若用保温箱，ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃。
3. 洗涤：在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。ELSIA洗涤以达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离。
4. 显色：显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。底物要临用前30 min配制且必须避光。
5. 比色：读取结果要在15～30 min内完成，定性测定用肉眼判读试验结果时，反应板应水平距离白色背景10~15 cm；定量测定时用酶标仪读取结果，酶标仪不应置于阳光或强光照射下，需先预热15～30 min再进行测试。
（李宏钊、支蕾）
