实验二  小鼠免疫器官观察

【目的要求】

了解小鼠中枢和外周免疫器官的解剖位置和形态特点。

【实验原理】

免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官，中枢免疫器官是机体免疫细胞发生、分化和成熟的场所，包括骨髓、胸腺和腔上囊（禽类），外周免疫器官是机体免疫细胞定居和发生免疫应答的场所，包括脾、淋巴结和黏膜相关淋巴组织。 

骨髓是各类血细胞和免疫细胞发生的场所。骨髓位于骨髓腔中，分为红骨髓和黄骨髓。红骨髓有造血功能，由造血组织和血窦构成。造血组织主要由基质细胞和造血细胞组成。基质细胞包括网状细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等。

胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所。胸腺位于胸腔纵隔上部，胸骨后方。胸腺在胚胎期及出生后2岁内生长很快，体积较大；2岁后到青春期发育仍很快；但青春期后开始萎缩，逐渐由脂肪组织所代替，它在机体免疫功能的建立上占有重要地位。骨髓内有部分淋巴细胞迁移到胸腺内，在胸腺素的影响下，增殖分化成为具有免疫功能的T细胞，再经血流输送到淋巴结和脾等周围免疫器官发挥免疫功能。胸腺分左右两叶，表面覆盖有一层结缔组织被膜，被膜深入实质将实质分割成若干小叶。胸腺小叶的外层为皮质，内层为髓质。胸腺皮质区分为浅皮质区和深皮质区。皮质区内85%-90%的细胞为未成熟的T细胞。髓质区内有大量的胸腺上皮细胞和稀疏分散的较成熟的胸腺细胞、单核-巨噬细胞和DC。

脾是人体最大的外周免疫器官。脾实质可分为白髓和红髓。白髓为密集的淋巴组织，为T细胞区。白髓与红髓交界的狭窄区域为边缘区，内含T细胞、B细胞和较多Mφ。红髓有髓索和髓窦组成。髓索为索条状组织，主要含B细胞、浆细胞、Mφ和DC。

淋巴结广泛存在于全身非黏膜部位的淋巴通道上，是结构最完备的外周免疫器官，淋巴结的实质分为皮质区和髓质区两部分。皮质区分为浅皮质区和深皮质区两部分。浅皮质区靠近被膜下，是B细胞定居的场所，为非胸腺依赖区。该区内大量B细胞聚集形成淋巴滤泡，或称淋巴小结。浅皮质区与髓质之间的深皮质区又称副皮质区，是T细胞定居的场所，为胸腺依赖区。髓质区有髓索和髓窦组成，髓索由致密聚集的淋巴细胞组成，主要为B细胞和浆细胞。

      黏膜相关淋巴组织主要指呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道黏膜固有层和上皮细胞下散在的无被膜淋巴组织，以及某些带有生发中心的器官化的淋巴组织，如扁桃体、小肠的派氏集合淋巴结以及阑尾等。

小鼠是免疫学研究中常用的实验动物，本实验通过对小鼠进行解剖，了解小鼠免疫器官的解剖位置和形态特点（胸腺、脾、淋巴结）。小鼠的胸腺是由左右两叶组成，似等边三角形，位于胸腔前纵隔，胸骨柄后面、心脏上方。新鲜的胸腺呈淡红色，表面不光滑，呈不规则的分叶状，大小与结构随年龄而变化。小鼠的脾脏呈绛紫色，长条形表面光滑，位于腹腔的左侧背部、肋骨下面，脾脏略向后弯曲，延伸于左肾和胃大弯之间。小鼠的淋巴结为灰褐色，球形表面平滑，全身分布广泛，有颈前淋巴结、颈后淋巴结、颌下淋巴结、胸淋巴结、腋窝淋巴结、肘淋巴结、腰淋巴结、腹股沟淋巴结、肾淋巴结、肠淋巴结、膝淋巴结和尾淋巴结等，未曾感染的小鼠淋巴结体积微小，肉眼很难观察到。

【材料】

1．小鼠。

2．解剖剪子、镊子等常规外科解剖器械。

3．5％石炭酸消毒液。

【方法】

1．取一只小鼠断颈处死，将其浸泡于5%石炭酸溶液中1-2分钟。

2．将小鼠腹部向上以大头针固定四肢于石蜡盘上。

3．以镊子将小鼠耻骨联合处的皮肤提起并用剪子剪一切口，再以镊子将切口部位的皮肤夹住并翻转撕脱至小鼠颈部。

在腋窝和腹股沟处皮下组织中有时可观察到肿大的淋巴结。

5．剪开腹壁，打开腹腔，在腹腔的左上部，胃的后下部可见一长条形绛红色器官，即为脾脏。

沿胸骨两侧将小鼠肋骨剪断，再将横膈膜断开，并将胸骨翻转，暴露出位于胸骨柄后方心脏上方的胸腺。

图2-1  小鼠主要免疫器官解剖示意图

[附] 小鼠骨髓单个核细胞的提取

（1）小鼠摘眼球放血后断颈处死后将小鼠放入75%乙醇中浸泡5分钟，取出小鼠，无菌条件下剪开股骨处皮肤，剥离肌肉及软组织，用无菌PBS液冲洗胫骨和股骨；

（2）用无菌剪刀将股骨与胫骨分离，再用无菌纱布包裹轻搓，彻底去除肌肉，浸泡于RPMI-1640培养液中；

（3）用10ml注射器针头分别从骨头两端刺入骨髓腔使其联通，然后吸取RPMI-1640培养基从一端刺入骨髓腔，另一端冲入无菌培养皿中，反复冲洗4~6次；

（4）用无菌200目滤网过滤冲洗下来的骨髓，去除杂质和组织碎片。1500rpm低速离心5分钟后用RPMI-1640培基重悬细胞；

（5）加入1ml 红细胞裂解液（NH4Cl 0.829g，KHCO3 0.1g， EDTA 0.037g溶解于100ml双蒸水中，过滤除菌）孵育1分钟，破除红细胞，再加入9ml培基，1500rpm离心5分钟后弃上清，再用RPMI-1640培养液洗两遍；

（6）RPMI-1640完全培养液（含10% FBS的RPMI-1640）重悬细胞后计数。

                                                         （白虹、张永慈）