实验一 抗毒素中和试验
【目的要求】
1. 观察破伤风外毒素对小鼠的毒性作用。
2. 观察破伤风抗毒素对破伤风外毒素的中和作用。
3. 掌握动物（小鼠）试验的基本操作技术。
【实验原理】
细菌毒素（Toxin）按其来源、性质和作用的不同可分为内毒素和外毒素两大类。
细菌内毒素（Endotoxin）是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。
细菌外毒素（Exotoxin）是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。能产生外毒素的细菌大多数是革兰氏阳性菌，少数是革兰氏阴性菌。将产生外毒素细菌的液体培养物用滤菌器过滤除菌，即能获得外毒素。其特点是：（1）化学成分是蛋白质，分子量为27000～900000道尔顿；（2）不稳定，易被热、酸及酶所灭活；（3）可经甲醛（0.3～0.4％）处理，丧失毒性而保留免疫原性成为类毒素；（4）抗原性强，可刺激机体产生高效价的抗毒素抗体；（5）具亲组织性，但作用于组织有选择性。外毒素一般不引起宿主发热，但常可抑制宿主蛋白质的合成，对宿主有细胞毒及神经毒性。如肉毒杆菌产生的肉毒毒素，能阻断胆碱能神经末梢传递介质（乙酰胆碱）的释放，麻痹运动神经末梢，出现眼、咽肌等麻痹；（6）毒性极强，极微量就可使实验动物死亡。如，纯化的肉毒杆菌外毒素1mg能杀死2千万只小白鼠。
机体经产生外毒素而致病的病原菌感染，即能产生抗体，称为抗毒素（antitoxin）。它能中和相应的外毒素的毒性作用。在医疗实践中，应用类毒素进行免疫预防接种，使机体产生相应的抗毒素，可以预防疾病。在临床治疗中，常用细菌的外毒素、类毒素对马进行免疫注射，使马产生抗毒素，然后取其血清，经浓缩提纯制成抗毒素。这种动物来源的抗毒素血清对人体具有两重性：一方面对病人提供了特异性抗毒素抗体，可中和体内相应的外毒素，起到防病治病的作用；另一方面，是具有抗原性的异种蛋白，能刺激人体产生抗马血清蛋白的抗体，以后再次接受马的免疫血清时，可能发生超敏反应。使用胃蛋白酶水解提纯的IgG分子，保留具有抗体活性的F(ab’) 2段，尽可能除去特异性抗原决定簇，既能大大提高抗体效价，也可以减轻副作用，减少超敏反应的发生。
本实验验证破伤风抗毒素对外毒素的中和作用。
破伤风外毒素包括痉挛毒素和溶血毒素。痉挛毒素具有神经亲和性，可随血液循环、淋巴循环附着在血清球蛋白上，到达脊髓前角灰质或脑干的运动神经核，继而结合在灰质中突触小体膜的神经节甙脂上，使其不能释放抑制性递质，运动神经系统失去正常的抑制性，导致全身横纹肌的紧张性收缩或阵挛。如给有免疫力的或事先给已被动免疫的动物注射一定剂量的毒素时，动物不产生中毒症状；而对未进行被动免疫的动物则可出现中毒症状甚至死亡。
【材料】
1. 小鼠（昆明鼠），2只/组
2. 破伤风外毒素
3. 破伤风抗毒素
4. 注射器（1ml）、碘酒、酒精、干棉球
5. 小鼠标记用染料（2%~3%苦味酸），一次性手套
【方法】
1. 实验组：取小鼠1只，常规皮肤消毒，腹腔注射破伤风抗毒素0.2ml，于一侧后肢肌肉注射破伤风外毒素0.2ml。
2. 对照组：取小鼠1只，常规皮肤消毒，于一侧后肢肌肉注射破伤风外毒素0.2ml。
3. 分别标记两只小鼠，放回饲养笼，次日观察结果。
附：小鼠抓取及注射方法
1．小鼠捉持法：右手提起鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，向后上方轻拉，此时小鼠前肢紧紧抓住粗糙表面不动（A），迅速用左手拇指和食指捏住其头部皮肤和双耳（B），其余三指和掌心夹住其背部皮肤及尾部，将小鼠固定于手中（C）（见图1－1）。捉持小鼠应小心，避免被鼠咬伤。
图1-1 小鼠捉持法示意图
2．小鼠腹腔注射法：左手将小鼠握持固定，使其腹部朝上，呈头低臀高位，右手持注射器，在左侧下腹部将针头与皮肤呈45°角方向穿过皮下、腹肌刺入腹腔。进针部位不宜太高，刺入不能太深，针尖进入腹腔时可有抵抗消失感，抽吸无回血或尿液，此时可轻轻推注药液（见图1—2）。
图1-2 小鼠腹腔注射法示意图
3．用注射器吸取外毒素和抗毒素后，排空气泡时应用消毒干棉球堵住针头，以免污染环境。
（白虹、张永慈）
