PCR定点突变实验
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PCR定点突变实验
将0.2mL管置于冰上，根据表1配制PCR主混液。
注意事项：
所有不是酶的试剂需在室温下溶解，酶需在用时临时从冰箱中取出，用完后立即放回。
主混液在震荡器上混均，并离心机上短时间离心使液体沉于管底。
表1 PCR主混液(50μL)
| ddH2O | 36.5 μL |
质粒模板(pGFPuv) | 2 μL (10ng |
| Pfu缓冲液 | 5μL(10X |
| dNTP(各10mM) | 4 μL (0.2mM |
正向引物(F) | 1 μL |
反向引物(R) | 1 μL |
PfuDNA聚合酶 (2 U/μL | 0.5μL(0.02 U/μL) |
将样品置于PCR仪进行PCR反应。
按表2设置PCR反应程序（18 cycles)。
表2 PCR反应程序
| 1 | Initial denaturation | 5’ | 98 ˚C |
| 2 | Denaturation | 30’’ | 98 ˚C |
| 3 | Annealing | 30’’ | 55 ˚C |
| 4 | Elongation | 4’ | 72 ˚C |
| 5 | Go back to step 2 | X 25 cycles | |
| 6 | Final elongation | 7’ | 72 ˚C |
PCR实验操作讲解视频：
