实验十三 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化与筛选

(Preparation, Transformation and Screening of Competent E. Coli Cells )

实验目的

1. 掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2. 掌握将外源DNA 转入受体菌细胞及筛选转化体的方法。

一、受体菌条件

•安全宿主菌

• 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

• 感受态细胞: 经过处理而容易接受外源DNA分子的细胞。

    （一）转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段, 它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

   转化的主要方法：电击法、CaCl2。

     （二）CaCl2法原理

该发最先是由Cohen于1972年发现的。

其原理是：细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经42℃短时间热击处理，可促进细胞吸收DNA复合物。

将细菌放置在非选择培养基上生长一段时间，细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子基因得到表达；然后将此细菌培养物涂布在选择性培养基上，可选出所需的转化子。

二、试剂

1. 0.1mol/L CaCl2 (此试剂为实验的关键，尽量购买品级较高的产品：进口产品)。

   2. LB液体培养基：配置每升培养基，应在950ml去离子水中加入：胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g，酵母提取物（bacto-yeastextract） 5g，NaCl 10g，NaOH 调节pH 至7.0（每升加5mol/L NaOH 200μl）,加入去离子水至总体积为1L，121℃，1.01x105Pa高压蒸汽灭菌20分钟。

  3. LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入15g琼脂粉，高压蒸汽灭菌后4℃保存。

  4. 氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配置成100mg/ml溶液，-20℃保存。

三、实验原理与步骤

    所得细胞悬浮液即为感受态细胞，可4℃保存备用，或添加冷冻保护剂（ 终浓度为10% - 15%甘油）后超低温冷冻贮存（－70℃）。经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）。

    质粒的转化：

 实验操作流程：

为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素

1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好。密度过高或不足均会影响转化效率。

2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。

3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制（过滤）,最好分装保存于干燥的冷暗处。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 经高压灭菌处理, 所有的试剂都要灭菌, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

5、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。

6、利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（ 90mm 平板上不得超过 10

5个菌落），同时 37 ℃ 培养不应超过 20 小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。

四、思考题

1. 决定感受态细胞制备成败的关键步骤是什么？制备过程中需注意哪些问题？CaCl2法进行质粒转

化的原理是什么？

2. 常用的转化子筛选方法有哪些？解释具氨苄青霉素抗性的转化子在含氨苄青霉素的培养基中生长

的机理。