实验十二 目的基因与载体的限制性双酶切

                   Double Enzyme Digestion for Target Gene and Vector

实验目的

• 掌握限制性内切酶切割DNA的原理和基本技术，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ 切割目的基因和质粒载体，为后续连接做准备。

实验原理

• 限制性核酸内切酶能特异地识别和切割双链DNA中的碱基序列，形成一定长度和顺序的DNA片段• 本实验采用两种限制性核酸内切酶（BamHⅠ和HindⅢ），切割目的基因（PCR扩增产物）和质粒载体pQE30。• 其中BamHⅠ的识别序列和切口是：G↓GATCC，HindⅢ的识别序列和切口是：A↓AGCTT。

实验操作

1. 取干净的小离心管，按如下反应体系配制溶液

试剂加完后用手指轻弹管壁使溶液混匀，然后短暂离心（5 s）使溶液集中在管底。

2. 37 ℃水浴，酶切2 h。

3. 取5 uL反应液进行琼脂糖凝胶电泳，分析鉴定酶切效果。

4. 终止反应：将酶切后的DNA溶液置于65 ℃，20 min以灭活内切酶

注意事项

1. 限制性内切酶多保存于50%甘油中， 于-20 ℃储存。为避免酶失活，加酶的操作应尽可能快。酶用完后需立即放回冰箱。

2. 内切酶的用量一般以１µg DNA对2-3 U酶为宜。

3. 注意酶的星号活性（star activity）。

4. 作为需酶切的DNA样品，不能含有酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等。这些因素的存在会不同程度地影响限制性内切酶的活力或使酶产生星号活性。

5. 不同的内切酶需特定的反应缓冲液，有时单酶切和双酶切需选择不同的反应缓冲液，需根据产品说明书加以选择。

思考题

1. 影响酶切反应的因素有哪些？

2. 何为酶的星号活性？如何克服？