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实验十一 质粒DNA的小量快速提取（碱裂解法）
Minipreparation of Plasmid DNA (AlkalineLysis Method)
实验目的
• 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。
一、简介
质粒 (plasmid)
特点：
能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗性状。
（一）载体的选择标准
• 能自主复制；
• 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
• 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；
• 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
（二）质粒的复制型
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:– 严谨型(Stringent control) ：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒– 松弛型(Relaxed control) ：质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中含有10-200个拷贝。
1、质粒提取的主要步骤：
•细菌的培养
•细菌的收集和裂解
•质粒 DNA 的分离和纯化
2、提纯思路
• 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA
• 要去除的物质：蛋白、基因组DNA、RNA
3、碱裂解法抽提质粒
（1） 手工碱裂解法抽提质粒
（2）质粒提取试剂盒(离心柱型)
二、实验原理
• 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们。
• 在碱性pH，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离。
• 当用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，质粒DNA分子能够迅速准确地复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去。
• 再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用无水乙醇沉淀质粒DNA。
☆原理示意图
（一）手工碱裂解法抽提质粒
试剂：
溶液I ：50mM 葡萄糖， 25mM Tris·HCl（pH8.0），10mM EDTA
– 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活。
溶液II： 0.2N NaOH， 1% SDS（新鲜配制）
– 作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。
溶液III： 3M KAc，5M HAc
– 作用：加酸中和后质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋基因组DNA沉淀，K+可置换Na+形成PDS（十二烷基硫酸钾）沉淀。
平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：酚/氯仿可使蛋白质变性，并有助于液相与有机相的分离，使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫。
无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀
TE缓冲液（pH 8.0）：溶解DNA
实验仪器与材料：
1、仪器：超净工作台恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅
2、材料：1.5ml 离心管，加样枪，含有质粒pFastBac的大肠杆菌DH5α、LB液体培养基
三、实验操作
1．细菌培养 将含有pQE30质粒的大肠杆菌TG1 10 μL接种到10 mL含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB培养液中，37 ℃振摇过液。
2．收集菌体 取1.5 mL菌液转入离心管中，10 000 r/min离心1 min，弃上清。
3．悬浮细菌 将细菌沉淀重悬于100 μL用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡使细菌沉淀悬浮。注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则所提质粒DNA的纯度及得率会大大降低。
溶液Ⅰ的作用是分散细胞，并鳌合金属离子使能够破坏质粒DNA的DNase失活。
4．碱液裂解 加200 μL新配制的溶液Ⅱ。轻缓颠倒离心管6~8次，使管内内容物混匀，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置2 min。溶液Ⅱ的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱性条件下变性。
5．中和与复性 加150 μL用冰预冷的溶液Ⅲ。轻缓颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5 min。溶液Ⅲ的作用是使pH值恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA与蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。
6．离心沉淀 用台式高速离心机12 000 r/min 离心5 min，将含有质粒DNA的上清转入另一离心管中。
7．酚/氯仿抽提除蛋白 加等体积酚-氯仿，剧烈振荡混匀，静置3分钟待其分层后，12 000 r/min离心10min，将上层液转入另一离心管中。
8．乙醇沉淀质粒DNA 加入2倍体积的无水乙醇，振荡混合，静置5 min使质粒DNA形成沉淀。12 000 r/min 离心10 min收集质粒DNA沉淀，弃上清液。
9．乙醇洗盐 质粒DNA沉淀里含有一定量的盐分需除去。加1 mL 70％乙醇，轻缓摇动数次，12 000 r/min离心2 min。弃上清液。
10．溶解质粒DNA 待残余乙醇挥发干净后，加30 μL TE缓冲液（pH 8.0）溶解沉淀，加2 μL RNase A (10
mg/mL)，37 ℃保温30 min 以去除RNA。所得质粒DNA置-20 ℃保存备用。
四、DNA的保存
1、短期贮存：
4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的pH与DNA 贮存有关，pH为8时，可减少DNA脱氨反应，pH低于7.0 时DNA容易变性。
2、长期贮存：
置于TE缓冲液中-70℃可保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。
注意：
• 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！
离心的注意事项
1. 重量相等
离心管或试管需平衡（称重）
2. 位置对称
平衡好的离心管或试管需对称放置
五、思考题
1. 溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用分别是什么？加溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ时要注意哪些问题？
2. 实验中加入酚-氯仿、无水乙醇、70％乙醇和RNaseA的作用分别是什么？
