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2 课件
实验十 目的基因片段与载体的连接
(The Ligation of Target Gene and Vector )
实验目的
• 学习DNA片段的连接方法，将酶切后的PCR产物与质粒片段连接，构建重组DNA
一、简介
1、DNA重组
•DNA重组本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过DNA连接酶的作用插入到质粒载体中的过程。
•DNA片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。
2、DNA连接酶（DNA ligase）
•主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
•E.coli DNA 连接酶 催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。
•T4噬菌体DNA连接酶 催化DNA连接反应分为三步。
3、T4 DNA连接酶的
（1）工作原理
（2）T4 DNA连接酶的作用:
① T4DNA连接酶与辅助 因 子 ATP 形 成酶-AMP复合物。
② 酶-AMP复合物再结合到具有5-磷酸基和3’羟基缺口 的 DNA 分子上 ， 使DNA腺苷化。
③ 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
• T4 DNA连接酶还有一种E.coli DNA连接酶没有的特性：即可将两个平末端的双链DNA分子连接起来。
•平末端连接反应的机理目前还不清楚，总的来说平末端连接的效率比粘性末端的连接效率要低得多，可能是因为平末端DNA分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。
（3）T4 DNA连接酶的活性单位
1. Weiss单位（Weiss等,1968），现也称PPi单位，是指在37℃,20分钟内,催化1nM 32P从焦磷酸根置换到ATP所需酶量；
2. 1个粘性末端连接单位：指在20µl反应体系中，0.12µM (300µg/ml)的5'末端，16℃，反应30分钟，能使50% 的经Hind Ⅲ酶切的λDNA片段连接所需的酶量。
3. 1个Weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。
4、10×T4 DNA Ligase Buffer
• 10×T4 DNA Ligase Buffer：400mM TrisHCl(pH7.8),100mM MgCl2, 100mM DTT,5mM ATP。• ATP浓度：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。
• 含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。
• 与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接酶缓冲液长期置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期放置），临用时加入新配制的ATP母液。
5、载体及插入片段的量
• 适当的插入片段与载体分子的比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体∶插入片段摩尔数为1∶2-1∶3 。
二、DNA浓度的测定
• 方法一：荧光比色法
– 即将待测DNA样品与已知浓度的DNA标准品一起进行1％琼脂糖凝胶电泳（EB染色），由于DNA与EB结合后，在紫外光激发下产生的荧光强度与DNA含量成正比，可通过比较荧光强度，估计回收的目的基因片段和载体DNA的浓度。
• 方法二：紫外分光光度法
– 核酸的最大吸收波长在260nm处，且吸光度与核酸浓度成正比，利用这个性质可以用于核酸的定量测定。
– 实验研究表明，当石英比色皿为1cm、A260＝1.0时，双链DNA浓度为50ug/ml，单链DNA和RNA浓度为40ug/m1，单链寡聚核苷酸浓度为20ug/m1，由此可测定核酸样品的浓度。
– 该法适用于浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。
三、连接反应条件
• 连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时 粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于 短暂配对结构稳定的最适温度即12-16℃。
• 粘末端连接效率较高，加入0.2-1μl T4 DNA Ligase，可在室温或16℃反应1-3 小时完成反应；
• 平末端连接效率较低，加入1 μl T4 DNA Ligase，通常需要在16℃或4℃过夜完成反应。
四、实验操作
取干净的小离心管，按如下反应体系配制溶液.
溶液加完后用手指轻弹管壁使溶液混匀，然后用高速离心机短暂离心（3-5秒）使溶液集中在管底。
将离心管置于16℃，连接3h。
五、注意事项
1. 10×T4 DNA Ligase Buffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。
