实验七 目的基因的PCR扩增

(Gene Amplification by PCR)

PCR目的

•进行体外（试管内）DNA片段扩增

•能够扩增特异的基因

•能够扩增至百万倍

•优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等

一、PCR基本原理

•三步曲: 变性、退火、延伸

•类似于DNA的体内复制。

 –变性：待扩增DNA模板加热变性解链

 –退火：将反应混合物冷却至某一温度，使引物与靶序列退火

 –延伸：将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下延伸。

•这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

PCR：体外由引物介导的DNA酶促合成，也叫基因扩增。

        25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。

•PCR的主要用途

目的基因的克隆

基因的体外突变

DNA和RNA的微量分析

DNA序列测定

二、PCR体系基本组成成分（五要素）

模板DNA Template特异性引物Primer耐热TaqDNA聚合酶4种dNTPs含Mg2+的缓冲液

1、模板

•包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等

•RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板

•模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng…

过高：非特异产物增加

过低：产量降低

•对标本的纯度要求低，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

2、引物（Primers)

•是化学合成的寡核苷酸片段，能与模板特异结合

•引物决定PCR扩增产物的特异性和长度

•引物浓度：0.1 ~ 0.5 μmol/L

–偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。

–偏低：产量降低。

    设计引物应遵循以下原则：

①引物长度：15-30bp，常用为20 bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

④引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑤引物中有或能加上合适的酶切位点。被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑥引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(<70%)。

⑦引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）。

3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）

•是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物

•反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致

•浓度过高虽能加快反应速度，但非特异

性扩增也随之增加

•dNTP浓度：50 ~400 μmol/L

4、耐热DNA聚合酶

•从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的嗜热水生菌（Thermusaquaticus, Taq）中提取出来，有很高的热稳定性。

•Taq酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。

•最适酶量：2-4U（酶量过多，导致非特异性扩增）。

•TaqDNA聚合酶复制的保真性：

–TaqDNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。

–TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。

•PyrobestTMpolymerase 、PfuDNA polymerase：有较高的保真性，碱基错配率下降2 ~10倍。

5、镁离子浓度

•镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影响。

•虽然Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。

•当dNTP浓度为200 μmol/L时，MgCl2的浓度为1.5~2.0 mmol/L较宜。

6、反应缓冲液

•一般随TaqDNA聚合酶供应。

•标准缓冲液含：10mM Tris-HCl（pH8.3），50mM KCl，1.5mM MgCl2。

–10mMTris-Cl(pH8.3)：维持Taq酶作用环境的偏碱性

–50 mMKCl：促进引物退火，>50 mM会抑制Taq酶的活性。

•100 μg/ ml 牛血清白蛋白(BSA)：对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT) 也有类似作用。

7、标准的PCR反应体系

10×PCR Buffer 10 μl

4种dNTP混合物各200 μmol/L

引物10.2~1.0 μmol/L

引物20.2~1.0 μmol/L

模板DNA 0.1～2 μg

TaqDNA聚合酶2.5 U

Mg2+1.5 mmol/L

加双或三蒸水至100 μl

三、PCR反应条件

预变性94~95℃，5 min

•循环（25~35）

–变性94℃，30s

–退火52~60 ℃，30s

–延伸70~75℃，30~60s

•延伸72℃，10 min

1、变性温度和时间

•保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。

•一般情况下选择94℃，30s，可使各种复杂的DNA分子完全变性。

•温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

2、复性温度和时间

•复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定。引物长度在15～25bp 之间时，Tm=4(G+C)+2(A+T)。复性温度低于引物Tm值5 ℃左右。

•退火时间设置为30s，足以使引物与模板之间完全结合。

•复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。

3、延伸温度和时间

•一般位于Taq酶最适作用温度70～75℃之间。

•延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定：

–< 1Kb，1min足够；

–> 1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。

•延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 ℃，1min。

4、循环次数

•其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

•理论上说20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20～30次是比较合理的循环次数。

•循环次数越多，非特异扩增增加。

四、实验操作

1．在冰浴中将以下各成分加入一无菌0.2 ml离心管中。

•将上述混合液用手指轻弹管壁后再稍加离心（5秒），使溶液集中在管底，然后立即置于PCR仪上进行扩增。

2．PCR反应程序

①94℃，预变性5min；

②94℃，30s；

③53℃，30s；

④72℃，1m10s；

⑤go to ②, 循环30次；

⑥72℃，最后延伸5min；

⑦End

•预变性（Initial denaturation）：模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5min。

•最后延伸：在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15min．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

3．结束反应，PCR产物置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：取5 μl 进行琼脂糖凝胶电泳检测。

五、PTC-150 PCR仪使用方法

1．开机：打开电源开关，视窗上显示“SELF TEST”，10秒后，显示RUN-ENTER菜单“RUN PROGRAM, ENTER PROGRAM”准备执行程序。

2．放入样本管，盖好热盖。

3. 按下表所示各键的功能进行程序的编辑、列表和修改等。

•输入完成后，到RUN-ENTER菜单，选择程序，按“Proceed”，视窗上显示“Use heated lid”，选择“Yes”，开始运行程序。

六、思考题

1. 通过本实验，谈谈PCR反应体系中各成分在PCR反应中的作用。

2. 污染是PCR反应中最常见的问题，可采用哪些措施防止污染?

3. PCR引物设计的原则有哪些？如何进行PCR反应条件的选择？