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实验七 血清谷丙转氨酶活力的测定(改良赖氏法)
Determination of glutamicpyruvictransaminaseActivity in Serum (Modified ReitmanMethod)
实验目的1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的原理。
2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的方法。
3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义实验目的 实验目的
临床意义
谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic Transaminase，GPT)又称丙氨酸氨基转移酶(Alanine Transaminase，ALT)
GPT(ALT)广泛存在于机体各种组织中，但在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及肝细胞坏死，血清中谷丙转氨酶活性显著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此酶活性也可中度或轻度增高。
正常人各组织GOT及GPT活性 (单位/克湿组织)（下图）
组织 | GPT | GOT |
肝 | 44,000 | 142,000 |
肾 | 19,000 | 91,000 |
心 | 7,100 | 156,000 |
骨骼肌 | 4,800 | 99,000 |
胰腺 | 2,000 | 28,000 |
脾 | 1,200 | 14,000 |
肺 | 700 | 10,000 |
血清 | 16 | 20 |
• 转氨酶是反映肝实质性损害的重要指标。
– 谷丙转氨酶（GPT）主要位于肝细胞浆内。
– 谷草转氨酶（GOT）则除胞浆外，也见于线粒体内。
• 位于胞浆内的GPT较易逸出，故一般肝损害时，GPT的升高 大于 GOT的升高；
• 但在酒精性肝炎时，由于线粒体明显损伤，GOT 的升高明显 大于 GPT的升高。但GOT的特异性不GPT。
• GOT/GPT比值可作为肝损害严重程度的指标，轻度损害时比值小，严重损害时比值大。比值为 1.2～2.26时，常为暴发性肝炎。
一、实验原理
血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的 条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α- 酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的 生成量，即可计算酶活性的大小。
• 生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，产生丙酮酸 2,4-二硝基苯腙，后者在碱性环境中呈现红棕色。
• 颜色之深浅与丙酮酸含量成正比，与标准丙酮酸的 显色进行比较，即可测定丙酮酸的含量。
1、不同的酶活测定方法
• 一般临床上用以测定GPT及GOT活性的方法有改良 的穆氏法、金氏法及赖氏法，这些方法都是基于上述原理而设计的，操作也基本相同，只是这些实验的某些条件、活性单位的规定和计算有所差异。
• 改良的穆氏法（Mohun）规定血清在37℃（pH7.4） 的条件下，与底物作用30分钟后，每生成2.5μg 丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
• 金氏法（King）则规定在同上条件下，与底物作用60分钟后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
2、卡门氏单位的定义
在紫外分光光度计中，1ml血清(反应溶液总量为 3ml)在340nm波长下，用内径为1.0cm的比色皿，在25℃，1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下， 使NADH+H+变成NAD+，使光密度下降0.001为1个转氨酶 活性单位。
NADH在260nm和340nm处各有一 吸收峰，而NAD+只有260nm一处 吸收峰，因此以NADH为辅酶的各 种脱氢酶都可通过340nm光吸收 值的改变，定量测定酶活力。
3、改良赖氏法
赖氏法（Reitman）本身并未对转氨酶活性单位提出规定，他 是用卡门氏法（Karman）来定单位的。即用卡门氏法所测出的 单位数相当于赖氏法所产生的丙酮酸量的相关系数，套用卡门 氏单位而来。
由此可见，测定同一份血清的转氨酶活性，用不同方法测算，其值不一样。因而它们的正常值范围也可有显著差异。
二、试剂
• ALT底物液：α酮戊二酸，丙氨酸
• pH7.4磷酸缓冲液
• 丙酮酸标准液：2μmol/ml
• 2,4-二硝基苯肼溶液
• 0.4mol/L NaOH
三、实验操作
标准曲线的制作：
0
1
2
3
4
丙酮酸标准液(ml)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
ALT底物试剂(ml)
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4(ml)
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
2,4-二硝基苯肼
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
混匀，置37℃水浴 20 min
0.4mol/L NaOH
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
相当于GPT活性(卡门氏单位)
0.00
28
57
97
150
室温，10min 以蒸馏水调零点，用520nm波长比色，读取各管吸光度。各管读数减去对照管(O管)的光密度， 然后以光密度值为纵坐标，各管相应的转 氨酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。
2、酶活性测定：
测定前将底物缓冲液在37℃水浴中预温5分钟，再按下表操作。
T | C | |
血清(ml) | 0.1 | — |
ALT底物液(ml) | 0.5 | 0.5 |
混匀后，置37℃水浴中保温30分钟 | ||
2，4-二硝基苯肼液(ml) | 0.5 | 0.5 |
混匀后，置37℃水浴中保温20分钟 | ||
血清(ml) | — | 0.1 |
0.4mol/LNaOH(ml) | 5.0 | 5.0 |
混匀，室温中放置10min，以蒸馏水调零点，用520nm波 长比色，读取吸光度。用AT-AC查标准曲线，即得到待测血清 中所含ALT的酶活性。
参考值： 5~25卡门氏单位。
四、实验结果
标准曲线
0
1
2
3
4
A520nm
An-A0
卡门氏单位
0
28
57
97
150
2.血清ALT活性
T | C | |
A520nm | ||
AT-AC | ||
ALT活性 | ||
注：酶活性在97卡门 氏单位以下，标本经 稀释后与光密度值的 线性关系良好，酶作 用时间较短，更符合 酶测定要求。
五、注意事项
1、不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批本只做2-3个血清对照管求其平均值即可。
2、严重脂血症或黄疸、溶血的血清都能引起测定管OD值的增 加，因此，检测此类标本时，应作血清对照管。
3、赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好，超过此活力的标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释 倍数。
4、加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分振荡混匀，否则会影响重复性。
5、ALT底物液与2,4-二硝基苯肼液配制要准确。
6、除了丙酮酸与2,4-二硝基苯肼在碱性溶液中能成腙外，α-酮戊酸亦能与2,4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。
六、讨论
将实验结果与参考值比较，分析实验结果。
七、思考题
– 改良赖氏法采用终止法测定ALT活性，本实验 是如何终止酶促反应的？
– 比较赖氏法与卡门氏法的测定原理，说明两种 方法的联系与区别。
– 若用标准对照法完成此实验，试设计实验步骤。
