实验五 肝糖原的提取和鉴定 

一、实验目的

1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。

4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。

5. 正确掌握溶液转移的操作。

6. 正确操作使用分光光度计。

二、实验原理

（一）肝糖原的提取、鉴定

          糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

（二）肝糖原的鉴定

           糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。

     CuSO4+2NaOH ═ Na2 SO4+Cu(OH)2↓

   2Cu(OH)2+ C6H12O6 ═ 2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O

   2CuOH ═ Cu2O↓(红色)+H2O

三、实验材料

（一）仪器

1. 普通离心机，室温~100℃恒温水浴箱（×2），722型分光光度计，精度为10mg级电子天平（×1）

2. 剪刀（×1），镊子（×1），研钵（×1）

3. 试管架（×1），10mL离心管（×2），（100×15）mm试管（×6）

4. 刻度吸量管（2mL×1，5 mL×2），1000μL微量可调取液器（×1）

5. 100mL容量瓶（×1）

6. 白瓷反应板（×1）

（二）试剂

1. 小白鼠肝。

2. 95％乙醇。

3. 0.31mol/L(5％)三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（C2HCl3O2，163.39）5g，加蒸馏水溶解至100 mL。

4.  0.15mol/L NaCl溶液：称取8.8g NaCl加蒸馏水溶解至1000 mL。

5.  12mol/L HCl：浓HCl原液（36%~38%）。

6.  12.5mol/L(50％)NaOH：称取NaOH 50g，用蒸馏水溶解至100mL。

7. 碘试剂：碘l00mg和K1 200mg溶于50mL蒸馏水中。

8. 班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O7·5H2O，294.10）17.3g和无水碳酸钠（Na2C03，105.99）100g溶于蒸馏水700mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾人17.3％硫酸铜（CuSO4·5H2O，249.68） l00mL，边加边摇。再加蒸馏水至1000mL，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。

9.  5.35mol/L(30％)KOH溶液：称取KOH 30g，加蒸馏水溶解至100 mL。

四、操作步骤

糖原提取和鉴定    

      处死小白鼠，取出肝脏用生理盐水洗去附着的血液，用滤纸吸干，称取肝约1.2g,将肝迅速剪碎放入研钵中，加5%三氯乙酸2ml，研磨至糜状，再加5%三氯乙酸4ml，研匀过滤，直接滤于离心管中，弃残渣，加与滤液等体积的95%乙醇混匀，静置10分钟，离心3000r/min 5分钟。弃上清，沉淀加蒸馏水3ml,用玻璃棒搅拌使沉淀溶解。可见有乳样光泽。取该液2滴，放入白凹磁盘中，加入碘试剂1滴。观察弃颜色反应。

      取上溶液2ml，加浓盐酸10滴混匀。在沸水中煮沸20分种，取出冷却后用50%NaOH溶液中和（大约7~8滴）。取试管一支，加糖原水解液10滴，加班氏试剂2ml混匀。在沸水中煮沸1~2分钟。观察并记录现象，判定结果。

五、结果

六、思考题

1、在糖原提取过程中应该注意什么？

2、糖原酸水解后会产生什么物质？用班氏试剂检查后会产生什么现象？