实验二      蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝G-250染色法）

Quantitative Determination of Protein (Coomassie Brilliant Blue G-250 Staining Method)

实验目的

掌握考马斯亮蓝G-250染色法的原理 及测定方法。

问题

1. 混合样品中定量测定蛋白质含量的方法有很 多，比如Lowry法、考马斯亮蓝法、紫外分 光光度法、BCA法等。它们各自的原理有何不同？

2. 请查阅文献说明考马斯亮蓝染色法的主要优 点与缺点？哪些化学试剂对该方法的测定有干扰？

实验原理

考马斯亮蓝G-250染色法是1976年由Bradford建立的，因 此也称为Bradford法。染料考马斯亮（Coomassie brillient blue）G-250在一定浓度的乙醇和酸性溶液中，呈现红色。在 此溶液条件下，考马斯亮蓝G-250可以与蛋白质结合，并导致 考马斯亮蓝 G-250 的颜色从 红色变为蓝色 ，最大吸收峰从 465nm移至595nm。考马斯亮蓝G-250与蛋白质的复合物在595nm波长处具有很高的光吸收系数，并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。利用这一性质可以定量测定蛋白质的浓度。该法因操作简单，反应时间短，已成为蛋白质定量测定的 常用方法。

实验器材与试剂

（一）器材

721E可见光分光光度计、1cm的比色皿、试管、移液器、刻度吸管。

（二）试剂

1. 0.9%NaCl溶液。

2. 蛋白质标准液（125 ug/mL） 称取小牛血清蛋白12.5 mg加生理盐水至100 mL，溶解后分装，-20℃冰箱保存。

3. 考马斯亮蓝G250溶液 称取100mg考马斯亮蓝G250溶解于95%乙醇溶液50 mL中，加85%H3PO4（磷酸） 100mL，再加蒸馏水 定容至1000mL，置棕色瓶过夜，用双层滤纸过滤。

实验操作

1.蛋白质标准曲线的绘制

取小试管6支，按表7-1操作

2. 样品蛋白含量测定

取3支试管，按表7-2操作。

混匀静置5分钟后，以空白管调零，595nm室温比 色，根据标准曲线确定样品中蛋白质含量。

将标准管和测定管的吸光度带入标准对照法公式，也可计算出待测样品液的浓度。

思考题

1.    用标准曲线法与标准对照法测定蛋白质含量有何区别与意义？

2.    影响显色的因素有哪些？考马斯亮蓝法染色能力强，染色后比色杯如何清洗？