实验三 细胞内核酸和蛋白质的分布显示

[目的要求]

1、掌握常用的细胞化学反应显示细胞内核酸成分的原理和方法。

2、了解 DNA、RNA 在细胞内的分布。

3、掌握常用的细胞化学反应显示细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的原理和方法。

4、了解酸性蛋白和碱性蛋白在细胞内的一般分布。

[实验原理]

核酸是细胞内一类重要的化学成分，可分为 DNA 和 RNA 两大类。细胞经甲基绿—哌罗宁混合染料染色后，由于带有负电荷的核酸对碱性染料哌罗宁和甲基绿具有亲和力不同，而使 DNA 和 RNA 呈现出不同的颜色反应。甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它和聚合程度高的 DNA 分子具有很强的亲合力，而使 DNA 被染成绿色；哌罗宁分子上只有一个相对的正电荷，它仅和聚合程度较低的 RNA 分子相结合，使其染成红色；由此可将细胞内两种核酸的分布部位区分出来。

蛋白质是细胞内主要的化学成分之一，由于不同的蛋白质分子所带的酸性和碱性基团数目不同，在不同的 pH 值溶液中，蛋白质分子所带的静电荷也不同。在生理条件下，如果整个蛋白质所带的负电荷多，表明蛋白质含有的羧基较多，这类蛋白质称为酸性蛋白质，酸性蛋白质主要存在与细胞质和核仁中。如果整个蛋白质所带的正电荷多，表明蛋白质含有的氨基较多，这类蛋白质称为碱性蛋白质，碱性蛋白质主要存在与细胞核内。用三氯醋酸处理标本提出核酸后，再分别用不同 pH 值的固绿染液进行染色，可使酸性蛋白质或碱性蛋白质被染成绿色（在酸性固绿染液中，碱性蛋白质因其碱性基团被酸中和，与染料的亲和力而不被染上颜色；在碱性固绿染液中，酸性蛋白质则因其酸性基团被碱中和而不被染上颜色）。

[实验用品]

1、器材：显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、剪刀、刀片、镊子、吸管、解剖针等。

2、试剂：甲基绿－哌罗宁混合染液、纯丙酮、70％乙醇、 5%三氯醋酸、0.1%酸性固绿染液（pH2～5）、0.1%碱性固绿染液（pH8.0～8.5）。

3、材料：蟾蜍、洋葱鳞茎。

[实验内容]

（一）蟾蜍红细胞内 DNA 、RNA 的显示

（1）涂片：以破坏脊髓法处死蟾蜍，剖开胸腔，打开心包，小心地将心脏剪一小口，迅速取心脏血制成血涂片，室温晾干。

（2）固定：将晾干的血涂片浸入 70％乙醇中固定 5～10 分钟后，室温晾干。

（3）染色和分色：在玻片标本上滴上甲基绿－哌罗宁混合染液进行染色，染色 20 分钟后用蒸馏水冲洗，并用吸水纸吸去片上多余水分（涂片部分不宜吸得过干）。然后在纯丙酮中沾一下（2～3 秒）进行分色。

（4）观察：注意观察细胞质、细胞核和核仁的颜色，试解释为什么出现这种染色差异。

（二）蟾蜍红细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的显示

1、涂片：以破坏脊髓法处死蟾蜍，剖开胸腔，打开心包，小心地将心脏剪一小口，迅速取心脏血制成血涂片，使用干手器吹干。

2、固定：将晾干的血涂片浸入 70％乙醇中固定 5 分钟后，取出后用清水冲洗。

3、三氯醋酸处理：将固定冲洗后的血涂片浸入 90℃的 5%三氯醋酸中处理 15 分钟，取出后用清水反复冲洗涂片上的三氯醋酸。

4、染色：将冲洗后的血涂片标记后，平放在染色盘架上，在有标本的地方滴加染料（酸性蛋白质显示用 0.1%酸性固绿染液染色 5 分钟，碱性蛋白质显示用 0.1%碱性固绿染液染色 20 分钟），染色后用清水冲洗，晾干。

5、观察：先在低倍镜下观察，找到分散较好的部位转到油镜下观察。注意比较两张血涂片标本的细胞质、细胞核、核仁的颜色，对照原理分析染色差异，比较碱性蛋白质和

酸性蛋白质的分布差异。[作业]

1、绘图显示蟾蜍血细胞内 DNA 和 RNA 和分布（用红、蓝铅笔标识标本颜色），并注明各部分名称。

2、DNA 存在于细胞的哪些结构中？它与细胞生命活动过程中的哪些环节有关？

3、绘图显示蟾蜍血细胞内碱性蛋白质和酸性蛋白质的分布，注明各部分名称。

附：甲基绿 — 哌罗宁染液的配置

A 液：

① 5% 哌罗宁水溶液 4ml

② 2% 甲基绿水溶液 14ml

③ 蒸馏水 16ml

B 液：0.2 mol/L 醋酸缓冲液（下列溶液按 4：6 比例混合即成）

① 0.2 mol/L 醋酸溶液(取 1.2ml 醋酸加蒸馏水至 100ml) 4 份

② 0.2 mol/L 醋酸钠溶液(取 2.72g 醋酸钠加蒸馏水至 100ml 溶解) 6 份工作液：使用前将 17 份 A 液和 8 份 B 液混合即成，不宜久置。