【背景】20世纪80年代以后膜片钳技术得到广泛应用，1989年膜片钳技术又应用于脑片神经细胞上，建立了脑片膜片钳技术。脑片（brain slice）兼有在体脑实验和体外神经细胞培养的某些特点，如脑片能够复制出整体动物大多数电生理现象，模拟在体实验，并排除了血压、温度、电解质、血-脑脊液屏障等因素的干扰；脑片保持有完整的神经突起和神经解剖通路，有利于突触活性的研究；神经细胞培养只能使用新生动物，而脑片实验则可选用成年动物等。目前该技术已被广泛地应用于神经科学研究。

脑片膜片钳技术方法主要有可视法和盲法两种：前者是在显微镜直视下对神经细胞进行封接，这种方法要求脑片必须切得很薄，以利于镜下操作的可视性。如将红外微分干涉相差显微镜用于脑片膜片钳的方法，其直视效果更佳。盲法是在看不见神经细胞的情况下，用玻璃微电极对脑片连续进行穿插直至遇到神经细胞，然后进行封接。

目前，海马（hippocampus）脑片因其神经细胞的有序排列及完整解剖通路特点，已成为研究神经系统突触传递与可塑性的标本。另外，海马脑组织也因其对缺氧最敏感，而使海马脑片成为较理想的体外缺氧损伤机制研究的模型。

本实验是采用海马脑片可视法全细胞膜片钳记录技术，记录海马锥体神经细胞离子通道电流，了解脑片膜片钳技术的原理及脑片的制作过程。

【分析与思考】

 1．与单细胞膜片钳相比脑片膜片钳技术有何优势？

 2．为何常用海马脑片进行神经科学研究？

 3．如何制备海马脑片？

4．如何应用直视法脑片膜片钳全细胞记录？

 5．制备海马脑片时应注意哪些？

【实验对象】

出生 20d~30 d的 Wistar大鼠。

【实验条件】

膜片钳放大器，微电极拉制器，切片机，红外微分干涉相差显微镜，三维操纵器，电极抛光仪，玻璃微电极，电子天平，pH仪，恒温水浴箱，哺乳类动物手术器械，人工脑脊液等。

【实验设计】

根据给定的实验对象和条件，请设计一个实验，如何利用脑片膜片钳技术，记录海马锥体神经细胞离子通道电流。 

【参考实验方案】

【实验步骤与观察项目】

1．海马脑片的制备

将大鼠断头，立即取出脑组织并迅速置入低温人工脑脊液(0～4℃)中10～20ｓ，然后于大脑半球腹内侧分离出海马；将剥离出的海马头部切平，用滤纸吸干其上的人工脑脊液，在海马平齐的头部涂上少许瞬间黏合剂（502胶），然后一起垂直粘贴于振动切片机标本托上。在4℃和供氧混合气条件下，用振动切片机将海马切成厚度为 200μm的薄片。将切割后的全部脑片置于氧合的人工脑脊液（20℃~25℃）中孵育l h 待用。

2．直视法脑片膜片钳全细胞记录

将海马脑片用盖网固定在浴槽中，脑片浸没于液面下约 1rnm~2mrn，以防止脑片漂动。用输液泵以1~2ml/min的流速，持续向脑片浴槽中灌流氧合人工脑脊液，在红外微分干涉相差显微镜直视下，用微推进器使尖端直径为10μrn的微玻璃管接近脑片表面，将脑片表面的碎片残渣吹松动并吸走，从而暴露单一神经细胞，然后将玻璃微电极靠近神经细胞进行封接。在形成吉欧姆封接后，快速给予较强负压吸引或电击破膜，形成全细胞模式，施予不同条件及参数分别记录钠、钾和钙通道电流（详见第一章第二节）。

【注意事项】

1．取出脑组织应迅速置入低温人工脑脊液，以减少脑组织的损伤及缺氧。脑片制备操作应在3 min~5 min内完成。

2．剥离海马时切勿挤压，否则对制备出的海马脑片神经细胞活性影响很大。

3．灌流速度不要太快，以免脑片漂浮。