【背景】1976年Neher和 Sakmarm建立了可以记录离子通道电流来反映细胞膜上单一（或多个）离子通道分子活动的新技术，即膜片钳技术（Patch clamp recording technique）。该技术是用玻璃微电极与细胞表面紧密接触，形成吉欧姆(109Ω,GΩ)以上的高阻抗封接，使玻璃电极尖所在区域的细胞膜（即膜片）与其周围在电学上绝缘，然后在此基础上固定膜电位，对膜片或细胞离子通道电流进行监测和记录。钠电流（INa）是快反应细胞上重要的除极离子流，钠通道广泛存在于神经、骨骼肌、心肌细胞上。INa在膜电位-70 mV~-65 mV开始激活，持续时间较短，激活和失活都比较快，最大电流峰值在膜电位-40 mV~-30 mV。钠通道具有电压和时间依赖性，可被特异性阻断剂河豚毒素（TTX）或I类抗心律失常药所阻断。本实验的目的是直接观察细胞的钠通道电流，了解膜片钳技术的原理及其在医学研究中的应用。
【分析与思考】
1．何谓膜片钳技术？
2．膜片钳技术有哪些优势？
3．如何应用膜片钳技术观察离子单通道的活动？
4．膜片钳有几种基本记录模式？
５．如何制备大鼠海马神经元标本？
6．如何制备膜片钳实验用的玻璃微电极？
7．如何应用膜片钳技术记录钠离子单通道电流？
8．全细胞记录钠电流的参数是如何设置的？
9．如何证明所记录出来的电流为钠电流？
10．在分离细胞酶解消化时应注意哪些？
【实验对象】成年大鼠。
【实验条件】膜片钳放大器、微电极拉制器、显微镜、三维操纵器、电极抛光仪、玻璃微电极、电子天平、pH仪、恒温水浴箱、离心机、切片机、哺乳类动物手术器械、烧杯、试管、氧气瓶、胰蛋白酶、人工脑脊液。
【实验设计】根据给定的实验对象和条件，请设计一个实验，如何利用膜片钳技术，记录大鼠海马神经元钠通道离子电流。
【参考实验方案】
【实验步骤与观察项目】
1．单个神经细胞的急性酶分离
将大鼠断头，立即取出脑组织并迅速置入低温人工脑脊液(0～4℃)中10～20ｓ，；然后于大脑半球腹内侧分离出海马；将海马切成400μm的薄片，置于32℃人工脑脊液内孵育，连续通以5%CO2+95%O2混合气。30 min后换以含1g/L胰蛋白酶的人工脑脊液，酶解(32℃，40min)后用人工脑脊液洗脑片3次。将脑片重新置于32℃人工脑脊液内连续通以5%CO2+95%O2混合气孵育待用，取出部分脑片移入盛有氧饱和的人工脑脊液的离心管内，先后用尖端热处理的直径为400μm和150μｍ左右的吸管轻轻吹打，将离心管静止竖立约2min，取上部细胞悬液，加入培养皿内，约20min后细胞贴壁。此时即可在倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞贴壁后，即可进行膜片钳记录。
2．仪器的连接
仪器连接见膜片钳技术相应部分所示。
3．膜片钳微电极的制作
用微电极拉制器将玻璃毛细管经两步拉制成尖端直径约为 l μrn的微电极；为了提高吉欧姆封接的成功率，在显微镜下将微电极尖端接近抛光仪的热源进行抛光。然后用注射针或聚乙烯的细塑料管从电极尾部充灌电极内液到微电极中备用。
4．吉欧姆封接的形成和单通道电流的记录
将分离的大鼠海马单个细胞置于倒置显微镜的浴槽中，灌流液冲洗 10 min，待细胞贴壁后，把电极安放于放大器探头上，电极内应给予弱正压以保持尖端通畅、干净。在三维液压操纵器推进下使微电极尖端入浴液，由膜片钳放大器向微电极发放一电压为 10mV、波宽为40 ms的方波脉冲信号，检查电极尖端阻抗及观察封接形成过程。利用微推进器使微电极尖端靠近细胞。当微电极尖端与细胞表面接触后，可见应答电流减小。此时放掉正压，再向微电极尖端施以负压，应答电流进一步减小直至为零，形成吉欧姆封接，达到电化学绝缘。此为细胞贴附式膜片，如给予一个保持电位-120 mV、指令电位-50 mV的刺激，即可以记录到单通道电流。
5．神经细胞钠电流的全细胞记录
单通道电流记录之后快速给予较强负压吸引，或给予高电压电击破膜，使电极内液与细胞内液相通，则形成全细胞记录模式，调节快电容补偿，抵消电容性尖峰，调节放大器的慢电容补偿和串联电阻补偿来抵消瞬态电流。
采用电压钳制方式对细胞进行电压钳制，保持电位为-120 mV，指令电压在-90 mV~＋25mV，脉冲阶跃为 10 mV，刺激频率为 0.5 Hz，钳制时间为 40 ms。，采样频率为10kHz，即可引导出全细胞钠通道电流。在浴液中给予TTX 50μmol/L或给予I类抗心律失常药普罗帕酮 20 μmol／L，灌流10 min后，观察钠电流幅度的变化。
【注意事项】
1．在分离细胞时，注意酶量和消化时间，防止消化过度造成细胞损害，并保证浴液清洁，将有利高阻封接的形成。
2．选择用贴壁良好、立体感强、折光性好、表面光滑的细胞进行实验，可以提高实验的成功率。
3．在高阻封接后及实验过程中减少地面震动，以免细胞脱落。
#科学与人文#
电生理学简史
科学解决理论问题，技术解决实际问题。科学要解决的问题，是发现自然界中确凿的事实与现象之间的关系，并建立理论把事实与现象联系起来；技术的任务则是把科学的成果应用到实际问题中去。科学主要是和未知的领域打交道，其进展，尤其是重大的突破，是难以预料的；技术是在相对成熟的领域内工作，一般可以做比较准确的规划。
1849年E·H·杜布瓦-雷蒙发表了《动物电的研究》，他所发展的刺激技术（感应圈）和记录技术是电生理技术的先导。随着电子管的发明和应用，从不同组织引导出来微弱的生物电讯号得以放大并可观测。1920年，J．厄兰格和H·S·加塞（共同获得了1944年的诺贝尔生理学及医学奖）共同研究制成了以阴极射线示波器为基础的高灵敏度的增幅仪，从此单个神经纤维活动电位的正确波形记录获得成功，标志着现代电生理技术的开始。早期的电生理技术只能记录大量细胞的同步的电活动。1949年，G·凌宁等开始用微电极插入细胞内记录其电活动，使电生理技术达到细胞水平。
Cole和Marment设计了电压钳（voltage clamp）。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极向胞内补充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发生改变时，也能控制膜电位数值不变。后经Hodgkin和Huxley改进并成功地应用于神经纤维动作电位的研究 。其设计原理是根据离子作跨膜移动时形成了跨膜离子电流（I），而通透性即离子通过膜的难易程度，其膜电阻（R）的倒数，也就是膜电导（G）。因此，膜对某种离子通透性增大时，实际上时膜电阻变小，即膜对该离子的电导加大。根据欧姆定律U=IR，即I=U/R=UG，所以，只要固定膜两侧电位差（U）时，测出的跨膜电流（I）的变化，就可作为膜电导变化的度量，即可了解膜通透性的改变情况。
1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。
