请通过本章学习，回答下列问题：

[1]固相载体的种类和特点？

[2]常用酶和底物有哪些？

[3]ELISA的方法类型？

[4]ELISPOT的基本原理和临床应用？

[5]影响酶免疫试验的主要因素有哪些？

第一节  酶免疫试验的组成要素

1.酶免疫试验：三大经典免疫标记技术之一，可定性、定量和定位检测，优点多，广泛应用。

2.固相载体：包括微孔板、磁微粒和膜载体，各有特点。 

3.包被和封闭：抗原或抗体与固相载体结合过程称包被，未消除非特异性位点，再次包被过程称封闭。

4.常用的酶和底物：

①HRP→催化TMB→产生蓝色可溶底物→用于ELISA。

②HRP→催化AEC→产生红色不溶底物→用于ELISPOT。

③HRP→催化DAB→产生褐色不溶底物→用于免疫印迹。

④HRP→催化鲁米诺→底物发光→用于化学发光免疫试验。

⑤HRP→催化HPA→产生荧光→用于荧光免疫试验。

⑥ALP→催化PNP→产生黄色可溶底物→用于ELISA。

⑦ALP→催化BCIP/NBT→产生蓝色不溶底物→用于ELISPOT。

⑧ALP→催化AMPPD→底物发光→用于化学发光免疫试验。

⑨ALP→催化4-MUP→产生荧光→用于荧光免疫试验。

第二节  酶免疫试验的分类

第三节  酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.基本原理：抗原或抗体包被→加入待测抗体或抗原→加入酶标记抗原或抗体→孵育→洗涤→加入底物→显色反应→终止反应→测定吸光度→定性或定量分析。

2.方法类型：检测抗原有三种方法（双抗体夹心法、双位点一步法和竞争法）；检测抗体有四种方法（间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法）。

（1）双抗体夹心法：待测抗原上至少有两个以上表位，且表位相同，即两抗体相同。为避免相互干扰，待测抗原和酶标抗体分开加，需要两步温育和洗涤。

（2）双位点一步法：待测抗原上有两个不同的表位，即两种抗体不同。待测抗原和酶标抗体可同时加入并反应，只需一步温育和洗涤。但容易因抗原过量出现“钩状效应”，必要时可稀释标本。

（3）竞争法测抗原：用于检测只有一个表位，无法用双抗体夹心法检测的小分子抗原。两相同抗体竞争抗原，最终底物显色深浅与待测抗原含量成反比。

（4）间接法：检测抗体最常用方法，由于二抗通常为抗IgG抗体，而在标本中存在大量非特异性IgG，容易结合并产生假阳性反应，因此检测时可适当稀释标本。

（5）双抗原夹心法：类似于双抗体夹心法，可采用一步法，且“无钩端效应”。

（6）竞争法：通常包被抗原，待测抗体和酶标抗体竞争，显色结果与待测抗体呈负相关；但某些抗原量少或不稳定，则无法包被，因此只能包被抗体，检测时再加入抗原，由固相抗体与待测抗体竞争，再加入酶标抗体，虽然多一步“中和抗原”过程，但结果判定方法与前者相同。

（7）捕获法：用于检测特异性IgM，由于血清中IgM量远远低于IgG含量，为防止IgG干扰，先利用固相抗IgM抗体，捕获待测总IgM，再利用特异性抗原，检测出特异性IgM。

第四节  酶联免疫斑点试验（ELISPOT）

1.基本原理：结合了ELISA技术和细胞培养技术，主要用于细胞因子分泌细胞的定量测定。

2.方法及结果判定：96孔板→孔内覆盖PVDF膜→膜上包被特异性单抗（如抗IFN-γ单抗）→加入待检细胞（如PBMC）→加入细胞刺激物（如PHA）→细胞培养→细胞分泌细胞因子（如IFN-γ）→细胞因子与膜上特异性抗体结合→加入酶标记二抗或酶标生物素-亲和素系统→加入底物→显色→在膜上形成不溶的斑点→斑点数量即为分泌细胞因子数量、斑点深浅代表分泌细胞因子的量。计算公式：阳性细胞频率＝斑点数目/孔内细胞总数

第五节  发光酶免疫试验

1.基本原理：结合了酶免疫技术和化学发光免疫技术，主要用于微量物质的检测。酶催化底物发光，利用光检测仪检测发光强度，通过标准曲线计算待测物含量。

2.方法类型：主要包括化学发光酶免疫试验和荧光酶免疫试验。

第六节  均相酶免疫试验

1.基本原理：利用抗原抗体结合后导致酶活性改变，可在不分离的情况下，检测待测物含量，呈正相关。

2.方法类型：

①酶放大免疫实验技术（EMIT）

②克隆酶供体免疫试验（CEDIA）

第七节  酶免疫试验的临床应用

1.ELISA的临床应用：广泛用于临床疾病血液及其他体液标志物的定性测定。

2.ELISPOT的临床应用：结核感染T细胞检测（T-SPOT-TB检测）已被列入欧美许多国家结核诊疗指南，也被美国CDC推荐为卡介苗接种人群结合感染检测首选。

3.发光酶免疫试验的临床应用：主要用于标本中微量物质的定量检测，范围涵盖多种激素、肿瘤标志物、感染性疾病、自身抗体、药物监测等。

4.均相酶免疫试验的临床应用：用于吗啡、地高辛等小分子物质的检测。

第八节  影响酶免疫试验的主要因素

1.试剂盒原材料因素：包括抗原、抗体、固相载体、酶结合物等方面。

2.标本因素：血清标本中的类风湿因子、异嗜性抗体、医源性诱导的抗鼠Ig抗体、嗜靶抗原的自身抗体、补体、溶菌酶及交叉反应物质等。

3.实验室环境因素：温度、湿度等。

4.操作因素：试剂使用前室温平衡、洗液质量、微量加样器使用、试剂滴加角度和速度、温育时间、洗涤充分、显色时间、酶标仪使用等。

5.结果判定：ELISA定性测定时，确定“阴性”和“阳性”的分界线，即“阳性判断值（cut-off值）”，也称为临界值，简写为CO。常通过S/CO比值判定阳性和阴性。ELISA中除竞争法外，S/CO≥1判定为阳性，S/CO＜1判定为阴性，竞争法中则相反，S/CO＜1判定为阳性，S/CO≥1判定为阴性。处于cut-off值定域中的测定结果可归为可疑，即ELISA测定的“灰区”，此区标本可通过确认实验或追踪检测来确定到底是阳性反应还是阴性反应。