请通过本章学习，回答下列问题：

[1]荧光相关概念？

[2]荧光显微镜的特殊结构有哪些？

[3]间接免疫荧光试验的基本原理、注意事项和临床应用？

[4]时间分辨荧光免疫试验的基本原理、方法评价和临床应用？

[5]荧光偏振免疫试验的基本原理、方法评价和临床应用？

[6]影响荧光免疫试验的主要因素有哪些？

第一节  荧光免疫试验的组成要素

1.荧光免疫试验：荧光物质标记抗原或抗体；可定位、定性、定量；特异性、敏感性、直观性；最早应用。

2.荧光：可吸收激发光能量，通过电子跃迁和回落，以发射光（荧光）形式释放能量。 

3.荧光基本知识

（1）发射光谱：固定一个激发光波长，激发荧光物质后，在不同的波长下检测荧光强度，可反应荧光物质发出荧光的波长偏好。

（2）激发光谱：固定在某一波长上检测荧光物质发射出的荧光时，用不同波长的激发光照射荧光物质，可反应荧光物质对激发光波长的偏好。

（3）荧光效率：荧光物质吸收光能和转化光能的百分率。

（4）荧光寿命：荧光物质被激发并发出荧光，直到荧光衰减到一定程度所有的时间。

（5）荧光淬灭：某些理化因素可使荧光减弱甚至消失。

（6）荧光偏振：荧光物质转动速度决定了偏振光激发后形成的偏振荧光的偏振方向改变程度，如果荧光物质不转动，则发射光的偏振方向与激发光偏振方向相同（不改变）。

4.荧光物质的种类：异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）、藻红蛋白（PE）、镧系螯合物等。

5.荧光素标记方法：针对不同被标记物（抗原或抗体）制备不同的荧光素反应基团→混合→纯化→鉴定→保存；混合方法包括搅拌法和透析法。

6.荧光显微镜：与普通显微镜在以下几个方面不同。

（1）光源：需强激发光源，常用高压汞灯、氙灯、卤素灯等。

（2）滤光片：根据不同荧光物质选择不同滤光片。

①隔热滤光片：灯室内聚光镜前，激发光经过的第一个滤镜，用于阻断红外线通过，起到隔热作用。

②激发滤光片：光源和物镜之间，根据不同的荧光物质的激发光谱决定，用于滤出特定波长的激发光照射荧光物质，排除其他波长的光对最终检测荧光强度的影响。包括两种，紫外光滤片（只允许275～400nm紫外光通过）和蓝紫外光滤片（只允许325～500nm蓝紫外光通过）。

③吸收滤光片：物镜和目镜之间，根据激发光谱和发射光谱决定，用于阻断激发光，且应只允许荧光通过，一般透光范围为410～650nm，通常有橙黄色（OG）和淡绿黄色（GG）两种。

（3）光路：分为透射光和落射光两种形式，二者根据标本透光度（厚度）不同决定使用。

（4）聚光器：包括明视野、暗视野、相差荧光聚光器等。

（5）镜头：消色差目镜等。

第二节  间接免疫荧光试验

1.基本原理：间接免疫荧光试验（IFA）即通过标本抗原和抗体特异性结合，再与荧光素标记二抗结合，通过荧光显微镜观察，检测标本抗原或与之结合的待测抗体。

2.注意事项：

①荧光染色后应在短时间内完成观察，否则荧光减弱；

②检测时需设定三种对照，即阳性对照（阳性标本荧光对照）、阴性对照（阴性标本荧光对照）和荧光标记物对照（无标本荧光对照）；

③全过程应保证抗原片湿润；

④全过程保持平衡，方式因放置不平而至反应液流失。

第三节  流式荧光免疫试验

1.基本原理：荧光染料→不同种类配比→产生不同光谱荧光→制作微球→包被不同抗体→用于同时捕获不同抗原→检测各微球光谱的荧光强度→对捕获抗原定量分析。

2.方法分类：悬浮阵列/多指标同步分析（xMAP）和流式微球阵列（CBA），二者原理相似，但方法略有不同，前者采用多功能流式点阵仪对孔板进行检测，后者采用多通道流式细胞仪进行检测。

3.方法评价：优点是高通量、灵敏度高、灵活性好、操作简便、标准曲线范围宽、检测范围宽等；缺点是需特殊仪器设备。

第四节  时间分辨荧光免疫试验

1.基本原理：

①时间分辨：标本中各种无关物质受激发后都可以发出短波长荧光（非特异性荧光），干扰标本测定的特异性和灵敏度，这些非特异性荧光寿命短，不超过20ns，对普通的荧光检测有影响，但对镧系元素标记的荧光反应影响不大，因为镧系元素荧光寿命长（10～1000μs），检测时将检测窗口后移，可避开非特异性荧光干扰。

②Stokes位移：激发光谱和发射光谱的波长差，位移小表明可能有重叠而相互干扰，位移大则相互干扰小，镧系元素荧光光谱的Stokes大。

③其他：镧系元素的光谱窄，干扰小；美妙可激发1000次，相对比活性高；信号可以被增强。

2.方法评价：灵敏度高，可达1×mol/L（普通荧光免疫技术达1×mol/L）；分析范围广；结合物稳定，有效使用期长；测量快速，易于自动化；无污染。

第五节  荧光偏振免疫试验

1.基本原理：光线通过偏振器形成偏振光（蓝光，485nm），激发荧光物质后，发出波长不同的偏振光（绿光，525～550nm）且入射和出射的两种偏振光，偏振平面会因为荧光物质的旋转而改变。

2.方法评价：标本用量少；结合稳定，使用寿命长；方法重复性好；快速；易于自动化；适用于检测中小分子抗原物质。

第六节  荧光免疫试验的临床应用

1.间接免疫荧光试验：血清中自身抗体的检测；各种微生物的快速检查和鉴定；寄生虫感染的诊断；白细胞分化抗原的检测；人类白细胞抗原的检测；肿瘤组织中肿瘤标志物检测；激素和酶的组织定位。

2.时间分辨荧光免疫试验：主要包括内分泌激素、肿瘤标志物、抗体、病毒抗原、药物代谢分析等。

3.荧光偏振免疫试验：血清或体液中的小分子物质，临床药物浓度检测首选。

第七节  影响荧光免疫试验的主要因素

1.荧光素-抗体结合物：应考虑以下几个方面的因素，包括特异性和亲和力高的单克隆抗体、经吸收试验和抑制试验验证过的抗体特异性、当抗原含量为1g/L时，抗体效价＞1:16、荧光素-抗体结合比率（F/P）不同检测方法要求不同。

2.待检标本：

①抗原片制备：组织标本→石蜡切片、冷冻切片（常用）、印片；细胞标本→涂片、爬片；细菌标本→涂片。

②抗原片固定：丙酮→对冷冻切片固定较好；乙醇+冰醋酸→对涂片固定效果较好。

3.其他：反应时间、温度等，小量分装避光低温保存。