请通过本章学习，回答下列问题：

[1]什么是免疫原、免疫佐剂、人源化抗体、小分子抗体、双特异抗体、抗体库技术？

[2]细胞破碎的方法有哪些？

[3]可溶性抗原的纯化方法有哪些？

[4]佐剂的种类和作用机制有哪些？

[5]IgG类抗体的纯化方法有哪些？

[6]杂交瘤技术的基本原理是什么？

[7]单克隆抗体的鉴定方法有哪些？

[8]单克隆抗体的特性和应用有哪些？

第一节  免疫原的制备

免疫原是用来制备抗体的抗原（抗原纯则抗体纯，用于检测时交叉反应少）

一、颗粒性抗原

主要包括各种细胞抗原和细菌抗原（处理方法相对简单）

二、可溶性抗原

主要包括蛋白质、多糖、核酸等抗原（需要粗提后再纯化）

（一）粗提

1.组织抗原制备：洗净→剪碎→匀浆

2.细胞抗原制备：希望得到细胞膜、细胞质、细胞核等可溶性抗原，需要破碎细胞

（1）超声破碎法：操作简单，常用

（2）酶处理法：可用于溶解微生物和植物的细胞壁

（3）冻融法：对微生物作用差

（4）表面活性剂处理法：作用温和，常用，可用于提取核酸

（二）纯化

1.超速离心法：如可溶性抗原密度差异很大，可用此法

2.选择性沉淀法：①盐析法；②有机溶剂沉淀法；③聚合物沉淀法；④核酸沉淀剂法

3.凝胶层析法：大分子洗脱快

4.离子交换层析法：利用电荷不同结合，利用等电点解离洗脱

5.亲合层析法：利用特异性和可逆性原理

三、半抗原

多肽、多糖、激素、核苷、药物等无免疫原性，不能作为免疫原，必须连接载体，常用载体如下：

1.BSA (Bovine Serum Albumin)，牛血清白蛋白，最常用

2.KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)，血蓝蛋白，免疫原性强

3.OVA (Ovalbumin)，鸡卵白蛋白，常作为第二载体蛋白

第二节  免疫佐剂

连接载体后的可溶性抗原，免疫原性仍然很弱，必须同时使用佐剂，增强机体免疫应答反应

一、佐剂的种类

动物免疫使用弗氏佐剂，包括弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，首次免疫使用完全佐剂，再次免疫使用不完全佐剂，二者区别在于完全佐剂中含有卡介苗，免疫原性更强，二者使用时均需要与抗原乳化

二、佐剂的作用机制

1.延缓抗原降解，延长体内存留时间

2.诱导产生强烈的炎症反应，刺激APC的加工和提呈

3.刺激淋巴细胞增殖和分化

第三节  多克隆抗体的制备及应用 

天然抗原免疫动物获得的动物免疫血清，即为多克隆抗体，是含有针对多种抗原表位的混合抗体

一、免疫动物的选择

常用的有家兔、绵羊、小鼠、鸡等，目前认为禽类抗体优点较多

二、抗原剂量的选择

注意剂量过大，可能诱导出免疫耐受

三、免疫程序

遵循抗体产生的一般规律

四、采血方法

需鉴定效价后再放血，常用采血方法包括：颈动脉采血法、静脉采血法和心脏采血法

五、抗血清的鉴定及保存

1.效价测定：颗粒性抗原→凝集试验；可溶性抗原→双向免疫扩散或ELISA

2.纯度测定：SDS-PAGE电泳、高效液相、毛细管电泳

3.特异性鉴定：双向免疫扩散试验

4.亲和力鉴定：ELISA

六、抗体的纯化

（一）IgG类抗体的纯化

1.盐析法粗提：先硫酸铵盐析法粗提，在透析或凝胶法除盐

2.离子交换层析：葡聚糖凝胶，不吸附IgG，可除去其他杂蛋白

3.亲和层析：SPA特异性结合，调节pH和离子强度在洗脱

（二）特异性IgG类抗体的纯化

1.亲和层析：特异性抗原交联sepharose4B，过柱，再洗脱；也可交联非特异性抗原

2.吸附：固相非特异性抗原

七、多克隆抗体的特性和应用

1.某些疾病的紧急预防，如破伤风、新生儿溶血症等

2.某些感染性疾病和移植排斥反应等治疗

3.建立各种抗原检测的免疫测定方法

4.免疫印迹和免疫组化

第四节  单克隆抗体的制备及应用 

单克隆抗体是只识别一种抗原表位的单克隆杂交瘤细胞产生的单一种类抗体

一、杂交瘤技术的基本原理

• 淋巴细胞：可以产生抗体，但不能体外无限增殖（想用但不能用）

• 骨髓瘤细胞：可以体外无限增殖，但不能产生抗体（只希望用到无限增殖能力）

• 淋巴细胞+骨髓瘤细胞：既可以体外无线增殖，又可以产生抗体

• 淋巴细胞+淋巴细胞：虽然融合但不能无限增殖，即使融合也容易去除

• 骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞+骨髓瘤细胞：没有用处，必须去除。

      使用HAT选择培养基，A（氨基蝶呤）抑制DNA合成主要途径，细胞只能用替代途径，需要利用两种原料H（次黄嘌呤）和T（胸腺嘧啶）以及两种酶HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤核糖核酸转移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶）。H和T由培养基提供，但骨髓瘤细胞选用的是HGPRT缺陷型，因此单独的骨髓瘤细胞在HAT培养基中，无法使用H和T，因此不能用替代途径合成DNA，一段时间后自然死亡；而淋巴细胞+骨髓瘤细胞，细胞可以利用淋巴细胞中的HGPRT，因此能够使用替代途径合成DNA，可以无限增殖，由此达到筛选目的。

二、杂交瘤细胞的制备过程

可溶性抗原+佐剂→免疫小鼠→脾或淋巴结→提取淋巴细胞+骨髓瘤细胞→融合→筛选特异性融合细胞→有限稀释→筛选特异性单克隆融合细胞→鉴定抗体→扩大培养细胞→生产→纯化→保存→功能鉴定→应用

三、单克隆抗体的产生

1.动物体内诱生法：腹水收集，纯度较高

2.体外细胞培养法：收集细胞培养上清，杂蛋白质较多

四、单克隆抗体纯化

1.预处理：二氧化硅吸附法，去除脂蛋白、脂质、细胞碎片等

2.纯化：亲和层析法，SPA或抗小鼠Ig抗体交联琼脂糖

五、单克隆抗体鉴定

1.抗体效价测定：ELISA方法，效价可达100万以上

2.抗体特异性鉴定：特异性和相关抗原鉴定，用ELISA、间接荧光、免疫印迹、免疫组化等方法

3.Ig类型鉴定：ELISA方法鉴定Ig亚类，包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA类抗体

六、单克隆抗体的特性

1.高度特异性：无交叉反应

2.高度均一性：一种抗体

3.弱凝集反应和无沉淀反应：不易形成多抗原抗体的桥联

4.细胞毒性弱：介导抗体的效应不如多克隆抗体

5.对环境敏感：多克隆抗体即使某一抗体受到环境影响活性丧失，其他抗体还可能有活性

七、单克隆抗体的应用

1.临床检验诊断试剂：应用广泛

2.蛋白质纯化：亲和层析特异性抗原

3.肿瘤导向治疗：特异性杀伤

4.放射免疫显像技术：特异性显影

第五节  基因工程抗体及应用 

基因工程抗体是指用基因工程方法改造抗体，以适应不同的抗体使用需要

一、人源化抗体

其他物种抗体用于治疗有免疫原性，可进行人源化改造

二、小分子抗体

穿透力好，免疫原性弱，不会介导体内抗体反应，半衰期短

三、双特异抗体

一种抗体同时与两种不同抗原结合，可用于靶向治疗

四、抗体融合蛋白

抗体与其他蛋白融合的靶向应用

五、噬菌体抗体库技术

1.抗体库技术：将某种动物所有抗体可变区基因，克隆在质粒或噬菌体中，可以表达全部特异性抗体，利用特异性抗原与抗体库中抗体的结合，可筛选出携带特异性抗体基因的克隆，获得特异性抗体

2.噬菌体抗体库：PCR方法从人免疫细胞中扩增出整套抗体重链和轻链可变区基因，克隆到噬菌体载体上并可以表达在噬菌体表面，再利用特异性抗原结合筛选出带有抗体基因的噬菌体载体，克隆扩增后分泌表达

六、重组多克隆抗体

弥补单克隆抗体治疗效果不明显的缺陷，使用多种单克隆抗体混合治疗

七、基因工程抗体的应用

肿瘤治疗、影像分析、抗感染治疗、细胞内靶向治疗、临床诊断