第二节  微生物限度检查法

一、概述

（一）概念及应用范围

1．概念：微生物限度检查法是指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。微生物限度检查的意义是保证药品质量，反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。目的是确保药品的有效性和安全性。

2．应用范围：包括常用口服制剂与一般外用制剂。对这部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但不得有可疑致病菌的存在。

(二)供试品

为便于微生物的限度检查，一般需将供试品制备成供试溶液或悬浮液。供试液的制备应适应供试品的理化性质，不得改变污染微生物的数量和种类。

1．供试品的一般要求：

(1)一批检样单位的供试品需做多项检验：微生物、化学、药理等。首先应取出规定量供试品供微生物学检验，其余部分做其他检验。供试品收检后应及时检验，若有困难，应存放在该品种规定的储存条件下（一般为阴凉干燥处）。

(2)供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。

(3)供试品的取样必须在净化条件下，无菌操作，防止污染。

(4)供试品为固体，应先匀质化后再稀释。非水溶性油脂性供试品，须加放适宜的助溶剂或乳化剂，使其成为均匀的溶液或乳浊液方可供检。

(5)含有抑菌性成分的供试品，应采取适宜的方法（事前测试）消除抑菌成分的干扰，使阳性菌对照试验呈现阳性反应，方可对供试品的阴性结果做出报告。

2．供试液

供检样品经处理制备成供试液一般采用下列方法：

(1)机械分散法：适用于固体及油性基质的软膏供试品的方法主要有：①电动匀质装置，利用匀质器高速搅拌将固体药物粉碎并匀质化，本法效率高，匀质效果好，操作时间短；②研磨法，将供试品置灭菌研钵内，以手工方法碾碎固体药物，本法简单实用但费时，劳动强度大，易污染；③振荡器法，将供试品及稀释剂一并置于灭菌锥形瓶内，置振荡器上振荡，使固体药物分散、匀质，本法简单易行，供试品的分散和匀质在密闭容器中一次完成。但匀质效果较弱，特别是对水丸剂等较坚硬的供试品效果较差，分散时间长。

(2)乳化法：适用于油脂性供试品的处理。在供试品中加入适宜的乳化剂及稀释剂，在保温情况下混匀，（并可借助机械分散法）使之成为均匀分散的乳浊液。

(3)离心沉淀集菌法：适用于有抑菌作用的固体制剂及液体制剂。对水溶性抑菌成分采用一次离心集菌、去除上层液中的抑菌成分；对非水溶性抑菌成分采用二次离心，先低速离心去除沉淀物，将上层液再高速离心，收集沉淀物。

(4)薄膜过滤法：适用于液体制剂及水溶性固体制剂，某些脂性供试品可通过助溶后再用薄膜过滤法。

(5)树脂吸附法：利用树脂的离子交换作用，使药物的抑菌成分吸附在树脂上，使待检菌得以检出。

(6)加入灭活剂：适用于有抑菌作用的供试品处理，根据抑菌成分的理化特性,加入适宜的灭活剂，以消除其抑菌作用，便于检查待检菌。

二、常用微生物限度检查方法

在非灭菌的各种制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种有不同规定：①染菌量检查：包括细菌总数、霉菌总数及酵母菌总数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度；②控制菌检查：我国药典规定将大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌作为控制菌。

(一) 染菌量检查

药品染菌量检查包括细菌总数、霉菌总数及酵母菌总数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。

1．细菌总数检查：细菌总数检测是指查被检药品在单位重量或体积(每克或每毫升)内所含活菌总数的检查方法，以判断被检药品中被细菌污染的程度。细菌总数测定常用的方法有活菌计数法和直接计数法。前者以在固体培养基形成可见菌落作为计数依据。后者是利用显微镜或自动化仪器定量计数，所测得的结果,不仅包括活菌,也包括死菌。因此两种计数方法的结果有差异。药品的细菌计数通常采用活菌计数法。

我国药典收载的活菌计数法为平板菌落计数法，先使细胞分散、定位，增生形成可见菌落后进行计数。此法简便但受下列条件限制：①细胞分散程度，细菌分散充分时，菌落生长数多，反之菌落数就少。②培养基和培养条件限制，改变培养基或培养条件，就会影响被测菌种类与数量。③细菌的繁殖能力，有繁殖能力的菌细胞才能被认定为“活菌”，因此，仅有繁殖能力的菌细胞才能形成菌落，死菌及某些受损伤的细菌或营养要求苛刻的细菌不能在规定的培养基上形成菌落，因而不被计数，欲计数某些有特殊生长要求的细菌数，需采用相应的方法。

2．霉菌及酵母总数检查

固体制剂的霉菌计数，液体制剂的霉菌与酵母计数采用玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆的合剂分别用玫瑰红钠琼脂培养基计数霉菌数、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基计数酵母数，规定在20℃～25℃ 培养72小时后计菌落数。

霉菌及酵母总数检查，除上述平板菌落计数法外，还有表面涂抹平板法、滤膜培养法、酵母菌镜检计数法。表面涂抹平板法适用于污染比较严重的供试品，酵母菌镜检计数法可用于血球计数板或其他的计数板进行酵母菌计数。

3．细菌计数的意义：测定供试药品每克或每毫升中污染细菌的数量，是检测药品受微生物污染程度的重要标志，其意义是：

(1)保证药品的有效性：药品中的微生物数量与药品的疗效有直接联系。对于微生物制剂，有效菌数量越多，其药品疗效愈佳。但对于药品中污染菌的数量而言却是相反。微生物在其污染的药品中是处于动态的不稳妥定状态，随着污染时间延长,它们可能暂时处于停滞或者逐渐趋于死亡。但也可能在适宜的条件下，以药物为营养进行繁殖，其结果使药物产生一系列的物理和化学变化，例如固体药物变得粘湿、产生色素、出现异嗅；液体药物粘度改变、产生气体或沉淀等。微生物对药物的降解作用，使其有效成分迅速破坏、变质而失去疗效。药物中污染细菌的数量与上述质量变化有着必然因果联系。药物中污染细菌数量越多,药物变质而迅速失效的可能性越大。

(2)保证药品安全性：测定药品中的细菌数量虽然不考虑其污染菌种，但污染细菌总数越多，致病微生物的污染可能性越大。有人研究细菌数量和大肠菌群检出率的关系，结果证明药品中细菌数量越多，大肠菌群检出率也越高，大肠菌群的检出，意味着肠道致病菌存在的可能。

(3)衡量药品生产过程的卫生水平：微生物对药品的污染可在药品生产的各个环节中发生，原辅料、设备、环境、人员、工艺流程及质量管理水平的优劣直接影响药品的卫生质量，药品污染细菌数的高低是对上述条件作出综合评价的依据之一。卫生工艺条件差、质量管理水平低的生产单位,其生产药品的染菌量必然严重。

(二)控制菌的检查

1．大肠埃希菌：大肠埃希菌是人、畜肠道内的寄生菌，可随粪便排出，容易被检出，所以常作为粪便污染的指标。当从药品中检出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能有肠道致病菌和寄生虫卵的存在。因此，口服药品中不得检出大肠杆菌。

2．沙门菌：沙门菌被列为口服药品的必检项目。此菌主要寄生在人体和动物肠道内，可随粪便污染水源、食品和药品，能引起人类患伤寒、副伤寒、急性肠胃炎及败血症等疾病。因此规定口服药不得检出沙门菌。

3．金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌分布广，常可污染药品与食品，是葡萄球菌中致病力最强的一种，能导致人体局部化脓，严重者导致败血症。目前规定，凡外用药和眼科制剂都不得检出金黄色葡萄球菌。

4．铜绿假单胞菌：铜绿假单胞菌是条件性致病菌，广泛分布于自然界。在大面积烧伤、烫伤、眼科疾病或其他外伤情况下，常因继发感染铜绿假单胞菌，引起伤口化脓、菌血症、败血症、眼角溃疡甚至失明。铜绿假单胞菌抵抗力强，对许多抗生素和化疗剂不敏感。因此， 一般外用药和眼科制剂规定不得检出绿假单胞菌。

三、活螨的检查

螨属于节肢动物门，种类繁多，分布甚广。药品可因其原料、生产过程或包装、运输、贮存、销售等条件不良，受到螨的污染。螨类蛀食药品，尤其对大小蜜丸、糖浆类制剂，含糖分、脂肪和淀粉较多的中药材及其炮制品等危害较大，在一些西药制剂中也有染螨现象。螨可致药品变质失效，也可直接危害人体健康或传播疾病。例如中成药中发现的腐食酪螨等，对人具有致病力，能引起皮炎及消化系统、泌尿系统、呼吸系统的疾病等。因此，对于口服药品及创伤、黏膜与腔道等外用的制剂，必须进行严格的活螨检查。

活螨的检查方法主要有直接法、漂浮法和分离法三种。在上述三种分法中，第一、二法简单易行，而且效果好，检出率高，比较常用。而第三种方法，较费时，效率低，一般较少采用。