第二节 体外杀菌试验

杀菌试验主要用以评价药物对微生物的致死活性。

1．最低杀菌浓度或最低致死浓度的测定：最低杀菌浓度(Mhfimal bactericidal concentration，MBC)指该药物能杀死细菌的最低浓度。对广义的微生物而言，也可称之为最低致死浓度(minimal lethal concentration，MLC)。一般是将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入一定量的试验菌液，培养后可得该药物的MIC，取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC或MLC。

2．活菌计数法：活菌计数法是在一定浓度的定量药物内加人定量的试验菌，作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。如果药物作用后，存活菌数很少，也可采用微孔滤膜过滤法测定存活的细菌数。

3．石炭酸系数测定法：石炭酸系数又称酚系数，是以石炭酸为标准，在规定的试验条件下，作用一定时间，将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，所得杀菌效力的比值。石炭酸系数是了解消毒剂杀菌效力的一种方法。石炭酸系数的应用有一定局限性，因为某一消毒剂对伤寒沙门菌的石炭酸系数的大小并不能完全代表它对其它菌作用的强弱。另还有以下一些缺点：①有机物存在时消毒剂易失去活性；②不能测出消毒剂对组织可能具有的毒性；③随温度变化而影响测定结果；④只适用于同类消毒剂的杀菌效力测定，对非酚类、季铵盐及不稳定的次氯酸盐等均不能给予正确评价

体外联合抗菌试验

在药学工作中，常需检查两种抗菌药物在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不同pH或不同离子溶液的相互影响。如加强药物抗菌作用的称协同；减弱药物抗菌作用的称拮抗(antagonism)；相互无影响的称无关(indifference)；作用为二者之和的称累加。常用的联合抗菌试验的方法：

1．纸条试验：在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的效应。

2．梯度平板纸条试验：需先制备含药的梯度平板，将试验菌悬液涂布于梯度平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板中药物浓度递减的方向置于平板表面。培养后，如该待检药液对平板内的药物有加强作用，则可见沿纸条两边的抑菌区被扩大；反之则抑菌区缩小。

3．棋盘格法：棋盘格法是因在试验时将含两种不同浓度药物的试管按棋盘状排列而得名，用以评价两种药物同时用不同浓度进行联合试验时的抗菌活性。

体外抗病毒试验

病毒与细菌不同，需在活的易感细胞和动物体内繁殖，各种病毒对组织和动物嗜异性不同，有些病毒缺乏易感模型，须采用类似动物病毒或模拟致病系统。病毒检验方法复杂，判断抗病毒药物药效须做统计处理。有些病毒对人有易感性，需要特殊隔离条件，具有较强传染性的病毒需要在生物安全三级实验室进行。实验室工作人员对拟进行的病毒操作要尽可能地进行疫苗免疫。抗病毒试验通常从病毒感染复制环节中进行抗病毒药物的研究，如阻止病毒对敏感细胞的吸附、阻止病毒核酸的复制、阻止病毒信使RNA翻译成蛋白质等。有些药物特别是某些中草药也可通过促进机体的免疫功能使病毒感染得到治愈。体外抗病毒作用的检定受很多复杂因素影响，容易出现假阳性结果。因此，对实验结果需进行综合分析。

1．抗病毒药物的检测要求：根据不同的病毒，依其敏感性选择易感细胞。检测一般药物试验，设三个剂量组，同时测定病毒毒力。并设三个对照组：病毒对照、阳性药物对照和正常对照。实验最好重复三次。

2．体外抗病毒试验方法：病毒具有严格寄生性，需在活细胞内才能生长增殖。因此病毒的体外培养需选择易感细胞，用于病毒体外培养的细胞主要有原代细胞、二倍体细胞和传代细胞三种。体外抗病毒试验常用方法：

(1)病毒学方法：选择病毒易感细胞进行病毒体外培养，通过观察病毒感染引起的细胞病变(CPE)或病毒嗜斑(PFU)、测定病毒感染量(TCID₅₀)和病毒繁殖量等的变化，判定抗病毒药物对病毒的抑制效应。　

(2)免疫学方法：用病毒特异性抗体(抗原)检测病毒抗原(抗体)的方法，如：酶联免疫吸附法(ELISA)，放射免疫法(RIA)等。

(3)分子病毒学方法：随着分子生物学技术的发展和应用，目前可利用分子生物学技术检测病毒的核酸、等待代谢产物或酶的活性，分析病毒基因核酸序列和蛋白多肽的结构，了解病毒在复制过程中的变化。