第二节  抗生素产生菌的分离和筛选

一、制药用微生物的筛选流程

菌种的分离与筛选，不仅是把混杂的各类微生物有效地分开，得到纯种，更重要的是依着生产实际的要求，快速、准确地将能产生所需产物，或具有某种生化反应性能的菌种，从大量的微生物中挑选出来。菌种分离和筛选的方法有时是设计一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法，更多的是利用特定的方法分离，获得所需菌种后，再进行识别。

一般制药用微生物的筛选主要包括采样、增殖与分离、发酵、性能测定以及菌种选育等环节。

（一）制药用微生物的分离

制药用微生物的分离和筛选是研究开发微生物药物的第一步工作。

1.采集样品：采土需注意土壤的环境和性质、采土的时机、记录、无菌操作等。一般来说，含有机氮较多的中性土壤中，放线菌和细菌占多数；含有机氮较少的酸性土壤中，真菌较多。土壤样品通常采表土层(5～10cm)，放于无菌容器。采土季节以春秋两季为宜。

2．放线菌的分离：为了富集所需要的各种放线菌，利用菌株的生物学差异，用物理或化学的方法除去细菌及目的以外的放线菌。通常分离放线菌多采用合成培养基(如精氨酸培养基、天门冬素培养基、察氏培养基等)和有机培养基(如Waksman培养基、Bennett培养基)。分离放线菌的培养温度一般为25～30℃，培养7～14d。

在培养过程中，选择适宜的抑制剂，有利于目的菌的分离。如分离放线菌时，加入抗真菌试剂(例如制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮等)和抗细菌抗生素(如青霉素和链霉素等)以抑制真菌和细菌的生长，可增加放线菌的分出率。

3．其他微生物的分离：由于各类微生物所存在地区的生态环境、生长习性、营养需要等不同，因此，应依据不同微生物来考虑设计适合的培养基和培养条件。①真菌的分离，分离腐生丝状真菌常用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、Martin琼脂培养基等，pH通常偏酸性。为了抑制细菌的生长，一般在分离培养基中加入β-内酰胺类和氨基糖苷类等抗生素。②细菌的分离，分离细菌常用有机培养基，如牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、营养琼脂培养基等，pH偏碱性。为了有利于细菌的分离，常在分离培养基中加入一定量的抗真菌抗生素以抑制真菌生长。加入多黏菌素可以大大减少G^-菌的生长，使G⁺菌得以富集。

随着基因克隆技术、细胞培养、DNA扩增等现代生物技术的不断发展，人们利用基因工程手段，把存在于土壤中目前还无法分离出来的土壤微生物的总DNA克隆到预先设定的宿主系统中，生成各种带有未知微生物DNA的“工程菌株”，然后再将这些“工程菌株”进行发酵、初筛、复筛等，以发现新的微生物产生的新化合物。

另外，特殊生态环境（如高温、高盐等极端环境、海洋中）微生物的分离，需考虑它们生长繁殖所需的特殊条件，以设计分离与培养条件。

4．菌种的选留：经培养后挑取放线菌菌落移种于斜面，经斜面培养后，获得纯培养。根据菌的形态、培养特征，初步排除相同菌。也可使用DNA-DNA杂交、代谢产物的HPLC分析、脉冲场凝胶电泳的低频限制性酶切片段分析和RAPD(随机扩增多态DNA)的方法来改进这一过程。

（二）制药用产生菌的筛选

筛选是指从大量分离到的微生物中鉴别出极少数有实用价值的药物产生菌的过程。无论是从自然界分离目标菌株还是在基因或菌种改造的过程中，合适的筛选模型是必不可少的。所谓筛选模型就是设计一种培养方法，在这种方法中必定包含着某些特定参数的控制(或测定或观察或添加某种化合物)，才能得到理想的突变株。下面仅以抗生素、氨基酸及酶产生菌的筛选为例简要说明制药用微生物的筛选过程。

1.抗生素产生菌筛选方法：在新抗生素产生菌的筛选中，应根据筛选目的选择合适的筛选模型和筛选方法。以下以产抗生素放线菌的筛选为例简要介绍抗生素产生菌的筛选。

（1）筛选模型：抗生素产生菌筛选模型是指在筛选中为了检测菌株产生的抗生素生物学活性而使用的试验菌、噬菌体、肿瘤细胞等。为了避免感染病原菌的危险，通常选用致病性相对弱、而又能代表某些类型病原菌的微生物作为试验菌。例如，用金黄色葡萄球菌代表G⁺球菌、枯草芽胞杆菌代表G⁺杆菌、耻垢分枝杆菌代表结核分枝杆菌、大肠埃希菌代表G^-杆菌、白假丝酵母菌代表酵母状真菌、曲霉代表丝状真菌、噬菌体代表病毒等。

（2）筛选方法：抗菌抗生素的筛选一般采用琼脂扩散法，即先制备含试验菌的琼脂平板，然后以含有放线菌摇瓶培养发酵液的滤纸片或一定大小的放线菌琼脂培养块放在含试验菌的平板上，培养后观察有无抑菌圈产生。另外，抗肿瘤抗生素的筛选可采用噬菌体、细胞膜缺陷型酵母突变株、精原细胞、肿瘤细胞等筛选方法。其原理是抗肿瘤、抗生素对以上的微生物或细胞有抑制作用。

2．氨基酸产生菌的筛选方法：氨基酸产生菌的分离方法一般采用平板分离法。分离培养基可分为营养贫乏培养基和营养丰富培养基。营养贫乏培养基由葡萄糖、铵盐、无机盐等组成，分离出的菌数不多，但以能够利用无机氮而不需要有机氮为主要特征。营养丰富培养基由葡萄糖、有机氮（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等）、无机盐等组成，分离出的菌量较多。从平板分离的菌落，用筛选培养基进行筛选，可以在平板上进行，也可以将微生物接种摇瓶培养后，用纸层析或微生物测定法检测生成的氨基酸。

设计适合氨基酸生产的筛选培养基及确定大规模筛选的氨基酸检测方法是氨基酸产生菌筛选过程中的两个关键环节。因部分菌种虽能在某一培养基上旺盛生长，但不一定能产生大量的氨基酸。例如，谷氨酸产生菌在营养上需要生物素，而生产大量谷氨酸则需要限制生物素的量。因此，必须根据氨基酸生物合成的知识来设计筛选培养基，既要考虑微生物生长的需要又要考虑氨基酸合成的需要。

3.微生物酶产生菌的筛选：筛选某些胞外酶（水解酶）产酶菌种时，可将酶的底物与培养基混合一起制成平板，然后涂布菌液，根据菌落周围对底物水解圈的大小，初步判断该菌株的产酶能力。例如，蛋白酶和淀粉酶菌种的筛选采用此法。因产生胞内酶的菌种难以在培养平板上直接测定其产酶性能，故产胞内酶菌种的筛选一般需将分离的菌种逐个进行摇瓶试验分别测定产酶情况。因酶的发酵生产受到诱导调节、酶作用的终产物阻抑调节、分解代谢物调节等多种调节作用，故在设计菌种筛选培养基时，应将这些因素考虑在内。

蛋白酶是催化蛋白质和多肽水解的一群酶类。蛋白酶可按照其作用的最适pH分为碱性、中性和酸性蛋白酶。研究表明，碱性蛋白酶的产生菌主要有短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草杆菌、嗜碱性芽胞杆菌和灰色链霉菌、米曲霉等；中性蛋白酶的产生菌主要有枯草杆菌、微紫青霉、米曲霉、灰色链霉菌等；酸性蛋白酶的产生菌主要有黑曲霉、斋藤曲霉、中华根霉等。

青霉素酰化酶能将青霉素水解为6-氨基青霉烷酸（简称6-APA）和侧链羧酸，也能催化相反的反应，在半合成青霉素的生产中具有重要作用。根据底物专一性，可将青霉素酰化酶分成两大类：①苯氧甲酸青霉素酰化酶，多数为胞外酶，对苯氧甲基青霉素（青霉素V）的裂解能力较强，产酶菌种有产黄青霉、头孢霉、曲霉、镰刀霉和某些酵母以及假单胞菌、微球菌、欧文菌、链霉菌等；②苄青霉素酰化酶，多数为胞内酶，对苄青霉素（青霉素G）的裂解能力很强，产酶菌种有大肠埃希菌、假单胞杆菌、微球菌、巨大芽胞杆菌、短杆菌以及链霉菌中的某些种类。在大量筛选时，常采用NIPAB（3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸）法测定青霉素酰化酶的活性。青霉素酰化酶生产中通常采用大肠埃希菌为生产菌种。

（三）早期鉴别与性能测定

经过筛选后获得的目的药物产生菌需早期鉴别与性能测定，鉴定过程中应从产生菌和其产生的目的药物两个方面进行鉴定，并和已知菌及已知药物进行比较。

（四）分离精制

将可能产生目的药物的产生菌进行扩大发酵培养，然后选择合适的方法将目的药物从培养液中提取出来，加以精制纯化。

（五）临床前试验研究

分离精制获得的目的药物样品必须先进行一系列的临床前试验研究。临床前研究包括对动物的（急性、亚急性、慢性）毒性试验、动物体内治疗试验、药物在动物体内的分布、排泄、代谢等动力学试验、摸索适宜的药物剂量、给药方式、了解药物不良反应、致突变、致癌、致畸胎情况等。

为了提高药品临床前研究的质量，确保实验资料的真实性、可靠性，保障用药安全，规范临床前试验管理，国家制定了《药品临床前研究质量管理规范》（Good Laboratory Practice For Nonclinical Studies，GLP）。GLP是临床前试验研究必须遵循的规范。临床前试验研究的结果需上报有关药政管理部门审查合格后方可进行临床试验。

（六）临床试验

临床试验是将药物应用到人体的试验。为了用药安全，国家制定了《药品临床试验管理规范》（Good Laboratory Practice For Clinical Studies，GCP）。凡新药进行各期临床试验、人体生物利用度或生物效应研究，均需严格按照GCP进行。经临床试验效果良好的药物，再经药政部门审查批准，才可投入生产和临床使用。