第五章  生物化学

 

生物化学（biochemistry）即生命的化学(lifechemistry)。它是研究生物体的化学分子和化学变化规律的一门科学。从分子水平探讨生命现象的本质。随着生物化学飞速发展已成为生命科学的共同语言及生命科学领域的前沿学科。本章主要内容为生物分子的结构与功能及物质代谢。

生物体是由许多复杂的分子结构按照严格的规律组成的高度有序的整体。机体生物大分子主要是蛋白质、核酸和酶等。研究生物大分子的结构与功能的关系，生物大分子之间的相互识别和相互作用，是当代生物化学研究的重要内容之一。

第一节  蛋白质结构与功能

蛋白质（protein）是由氨基酸通过肽键相连形成的生物分子。人体内具有生理功能的蛋白质是有序结构，每种蛋白质都有其一定的氨基酸百分组成及氨基酸排列顺序，以及肽链空间的特定排布位置。因此由氨基酸排列顺序及肽链的空间排布等所构成的蛋白质分子结构，才真正体现蛋白质是生命信息的体现者和功能执行者。蛋白质参与机体的一切生理活动，例如：酶的催化作用；运输和传递作用；调节和控制作用；运动作用；免疫防御功能等，所以蛋白质是生命的物质基础。

一、蛋白质的化学组成

蛋白质分子组成中的元素主要有碳、氢、氧和氮。蛋白质元素组成的特点是含氮量很接近，平均为16%，由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此测定生物样品中的含氮量就可按下式推算出蛋白质的大致含量。

每克样品的含氮量× 6.25 × 100 = 100g 样品中蛋白质含量（g %）

（一）蛋白质结构的基本单位  蛋白质水解的最终产物是氨基酸。因此，氨基酸是组成蛋白质的基本单位。

1.氨基酸的结构 

组成人体蛋白质的20种氨基酸，也称为编码氨基酸。氨基酸的结构有其共同特点。每个氨基酸分子（脯氨酸除外，属于亚氨基酸）的α-碳原子上都连接一个氨基、一个羧基、一个氢原子和一个侧链R基团，故称为α-氨基酸。各种氨基酸的差别就在于其R侧链的结构不同。其化学结构可用下列通式表示。

除R侧链为氢原子的甘氨酸外，α-碳原子均为不对称碳原子，具有旋光异构体，人体内组成蛋白质的氨基酸均属于Ｌ－α氨基酸（图5-1）。

                    图5-1  L-氨基酸和D-氨基酸

2．氨基酸的分类 

根据R基团的结构和性质，可将20种氨基酸分为四类：

（1）非极性R基团氨基酸：有八种，包括甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸表5-1。

（2）极性中性氨基酸：包括甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸七种氨基酸表5-2。

（3）负电荷的酸性氨基酸：包括天冬氨酸和谷氨酸表5-3。

（4）带正电荷的碱性氨基酸：包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸表5-4。

               

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

表 5-1 非极性R基团氨基酸

表5-3 R基团带负电荷的酸性氨基酸

 

表5-2   极性不带电荷R基团氨基酸

 

 

表5-4 R基团带正电荷的碱性氨基酸

蛋白质组成中除上述20种基本氨基酸外，少数蛋白质还存在一些不常见的特有氨基酸，这些氨基酸都是在蛋白质合成后，由常见的氨基酸经过化学修饰而形成的。另外在各种组织和细胞中发现其它氨基酸，它们不存在于蛋白质中，而是以游离或结合状态存在于生物体内，所以称为非蛋白质氨基酸。这些氨基酸虽然不参与蛋白质组成，但在生物体中往往具有一定的生理功能，

（二）肽结构 

自然界存在的蛋白质大约有10¹⁰～10¹²种，不同的蛋白质具有不同的结构。那么氨基酸之间是通过什么方式连接的？如何组成了数目繁多、结构各异的蛋白质大分子? 研究证明，蛋白质是由许多氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键连接起来的生物大分子。

1．肽键及肽链  

肽键是蛋白质分子中氨基酸之间的主要连接方式，它是由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基缩合脱水而形成的酰胺键。一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基之间失去一分子水相互连接而成的化合物称为肽，由n个氨基酸形成的肽称为n肽，一般来说n<10个氨基酸称为寡肽，由n>10个以上氨基酸称为多肽，一条肽链的两端有自由氨基和羧基，分别称为氨基末端或N-末端。肽链中α-碳原子和肽键的若干重复结构称为主链。肽链中的氨基酸不是原来完整的分子，因此称为氨基酸残基。肽的命名是从肽链的N-末端开始指向C端（图5-2）。

 

 

                       图5-2 肽键及肽链

2．谷胱甘肽 

生物体中有些肽具有特殊的生理功能。例如谷胱甘肽，谷胱甘肽（GSH）中含有一个活泼的巯基，所以很容易氧化，则两分子谷胱甘肽脱氢以二硫键相连形成氧化型的谷胱甘肽(GSSG)。谷胱甘肽参与细胞内的氧化还原作用，它是一种抗氧化剂，对许多酶具有保护功能：解毒功能；SH基团的嗜核性，能与外源的嗜电子毒物如致癌剂和药物等结合，以保护机体免遭毒物损害。GSH是细胞内重要还原剂；它保护蛋白质分子中的SH基团免遭氧化，使蛋白质或酶处在活性状态。

二、蛋白质分子结构

蛋白质的结构可以分为四个层次，即一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。其中一级结构又称蛋白质的基本结构。二级结构、三级结构和四级结构又称为蛋白质的空间结构或三维结构。蛋白质的空间结构涵盖了蛋白质分子中的每一个原子在三维空间的相对位置，它们是蛋白质特有性质和功能的结构基础。           

1.蛋白质的一级结构 

蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸残基排列顺序。一级结构是蛋白质分子结构的基础，它包含了决定蛋白质分子所有结构层次构象的全部信息。肽键是蛋白质一级结构的主要化学键。有些蛋白质还含有二硫键。

2．蛋白质的二级结构 

蛋白质分子中主链骨架的局部空间结构，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。蛋白质二级结构主要包括α—螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。维持蛋白质二级结构的化学键是氢键。

（1）α-螺旋   多肽链的主链围绕中心轴规律的螺旋式上升，盘旋成稳定的α-螺旋构象（图5-3）。α-螺旋具有以下特征：螺旋的走向为顺时钟方向，即右手螺旋；每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，螺距为0.54nm，所以每个氨基酸残基上升的高度为0.15nm。氢键是α-螺旋稳定的主要次级键； 每个肽键的亚氨基氢和第四个肽键的羰基氧形成氢键。氨基酸侧链伸向螺旋外侧，其形状、电荷、大小都会影响到螺旋的形成；例如。脯氨酸存在时α-螺旋就被中断，这是因为脯氨酸的α-亚氨基上氢原子参与肽键形成后就再没有多余的氢原子形成氢键，所以在有脯氨酸存在的地方就不能形成α-螺旋结构。

 

图 5-3  α-螺旋

（2）β-折叠  β-折叠结构又称为β-折叠片层结构。β-折叠结构是一种肽链相当伸展的结构，多肽链呈扇面状折叠（图5-4）。具有以下特点：多肽链充分伸展，每个肽单元以C_α为旋转点，依次折叠成锯齿结构；氨基酸侧链交替地位于锯齿状结构的上、下方；两条以上肽链或一条肽链内的若干肽段平行排列，通过链间羰基氧和亚氨基氢形成氢键，从而稳固β-折叠结构；肽链有顺式平行和反式平行两种。

 

图5-4  β-折叠结构

（3）β-转角 β-转角结构又称为β-回折、发夹结构和U型转折等。蛋白质分子多肽链在形成空间构象的时候，经常会出现180°的回折（转折）。

（4）无规卷曲  系指没有确定规律性的那部分肽链结构

（5）超二级结构   超二级结构指蛋白质分子中的多肽链相邻的二级结构的肽段，在空间上相互接近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体，如α-螺旋聚集体（αα型）、β-折叠聚集体（βββ型）以及α-螺旋和β-折叠的聚集体，常见的是βαβ型聚集体。锌指结构就是典型超二级结构，它有一个α-螺旋和两个β折叠组成。

3．蛋白质的三级结构  

指整条多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。蛋白质三级结构的形成和稳定主要靠次级键-疏水作用，离子键、氢键和Vander waals等。较大蛋白质的三级结构可形成数个结构域，各结构域都有特殊的功能。例如纤连蛋白每条多肽链含有6个结构域。

4．蛋白质的四级结构 

有些蛋白质分子含有二条或多条肽链，才能完整地表达功能。每一条多肽链都有其完整的三级结构，称为蛋白质的亚基，亚基与亚基之间呈特定的三维空间分布，并以非共价链连接，蛋白质分子中各亚基的空间分布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。维系四级结构的作用力主要是疏水作用，氢键和离子键也参与维持四级结构。四级结构的蛋白质中单独的亚基一般没有生物学功能。如血红蛋白有四个亚基组成并运输氧的功能，单独亚基不能运输氧的功能。

蛋白质的结构层次可总结为（图5-5）：

一级结构（肽链结构，指多肽链中的氨基酸排列顺序）

↓

二级结构（多肽链主链骨架盘绕折叠形成的有规律性的结构）

↓

超二级结构（相邻二级结构的聚集体）

↓

结构域（在空间上可明显区分的相对独立的区域性结构）

↓

三级结构（球状蛋白质中所有原子在空间的相对位置）

↓

四级结构（亚基聚合体）

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 5- 5  蛋白质各级结构之间关系

   三、蛋白质的结构与功能

   蛋白质是生命的基础，各种蛋白质都具有其特异的生物学功能，而所有这些功能又都与蛋白质分子的特异结构密切相关。蛋白质分子的一级结构是形成空间结构的物质基础，而蛋白质的生物功能是蛋白质分子特定的天然构象所表现的性质。

（一）蛋白质一级结构与功能的关系

1．蛋白质一级结构是空间构象的基础 

蛋白质一级结构决定空间结构，例如，核糖核酸酶是由124个氨基酸残基组成的一条肽链经不规则折叠形成一个近似于球形的蛋白质。维持核糖核酸酶构象稳定的因素除了次级键外还有4对二硫键。如果将天然的核糖核酸酶在8mol/L的尿素中用巯基乙醇处理，则分子中的4对二硫键和次级键被破坏，球状分子变成一条松散的多肽链，同时酶活性完全丧失。蛋白质变性后肽键不受影响，一级结构仍保持完整。如果用透析法除去尿素和巯基乙醇后，酶重新氧化又可自发地折叠成原来的天然构象（图5-5）。实验说明：蛋白质的变性（程度浅）是可逆的，同时也说明，蛋白质分子一级结构不被破坏，就可能恢复至原来活性。所以蛋白质一级结构是蛋白质的特定的空间结构基础。

 

             图5－6 牛核糖核酸酶一级结构与功能的关系

 

2．一级结构变化与分子病 

基因突变可以改变蛋白质的一级结构，从而改变蛋白质的生物活性甚至生理功能而发生疾病 分子病是指由基因突变造成蛋白质结构或合成量异常而导致的疾病。例如，镰刀形红细胞贫血病患者的血红蛋白（HbS）分子与正常人的血红蛋白分子(HbA)相比，在574个氨基酸中有2个氨基酸残基不同。正常人的血红蛋白的β-链N-端第6位氨基酸为谷氨酸，而患者的血红蛋白的β-链N-端第6位氨基酸为缬氨酸。谷氨酸带电荷而缬氨酸是非极性分子，患者血红蛋白分子表面的负电荷减少，导致血红蛋白分子不能正常聚合，溶解度降低，在细胞内易聚集沉淀，丧失了运输氧的能力，血球收缩成镰刀状，细胞脆弱而发生溶血。蛋白质的一级结构是蛋白质行使功能的基础，甚至只有一个氨基酸的改变就能引起功能的改变或丧失。

 

 

 

 

 

 

案例5-1   患者，女性，18岁。因发热、间歇性上下肢关节疼痛就诊。体格检查：体温38.5℃，轻度黄疸、肝脾肿大。   实验室检查：血红蛋白80g/L,血细胞比容9.5%,红细胞总数3×1014/L,白细胞总数6×109/L,网织红细胞计数0.12,血清铁21μmol/L，次亚硫酸氢钠试验阳性；Hb电泳一条带，与HbS同一条带。红细胞形态：镰刀状。      患者呈现明显的贫血症状（红细胞缺乏）、严重感染以及重要器官损伤。      诊断：镰刀状红细胞贫血。   问题讨论   1.镰刀状红细胞贫血患者的细胞学特征是什么？   2.HbS与HbA一级结构有什么区别？   3.HbS结构的变化对其功能有什么影响?

 

（二）蛋白质的空间结构与功能的关系 

蛋白质功能更依赖其特定的空间结构。

1．蛋白质空间结构改变与功能  

血红蛋白由2条α链和2条β链组成。4个亚基间通过8个盐键，紧密结合形成亲水的球状蛋白。未结合O₂时，亚基之间呈对角排列结构紧密与O₂亲和力小，称为紧张态（T态），当第1个O₂与亚基的Fe²⁺结合后，Fe²⁺半径变小，进入卟啉环的孔中影响附近肽段的构象，亚基间盐键断裂，空间结构变得松弛称为松驰态（R态），对O₂的亲和力增加。一个氧原子与血红蛋白亚基结合改变蛋白质现象称为变构效应。变构效应是酶调节代谢理论重要基础。

2．蛋白质空间结构改变与疾病 

多肽链的正确折叠对其构象的形成和功能发挥至关重要。因折叠错误导致蛋白质构象异常引起的疾病，称为蛋白质构象病。朊病毒病就是蛋白质构象疾病之一。朊病毒（prion，proteinaceous infectious only）是一类只有蛋白质而没有核酸的病原体。Prusiner因发现朊病毒而获得1997年诺贝尔生理学或医学奖。朊病毒蛋白（PrP）是存在于正常哺乳动物脑组织细胞膜上的一种糖蛋白，有两种构象：一种是正常的PrP^C构象，以α螺旋为主；另一种是致病的PrP^Sc构象，以β折叠为主。PrP^Sc分子可胁迫PrP^C构象转化成PrP^Sc构象，实现自我复制，并引起一系列致死性神经变性疾病。疯牛病和人类Creutzfeldt-Jakob disease,CJD等属于朊病毒病。这些疾病典型的共同症状是痴呆、丧失协调性以及神经系统障碍。

 

 

案例5-2      患者，男性，40岁。因进行性痴呆，间歇性肌阵挛发作半年入院。体格检查：反应迟钝，言语较少，理解力差，计算力下降，腱反射亢进，肌力3级，水平眼震，闭目难立征阳性。实验室检查：脑脊液蛋白0.6g/L；脑电图示弥漫性异常，表现为各区特征性周期发放的高伏双向尖波，间歇为0.5～2s；MRI提示：脑萎缩。      入院后经巴氯芬治疗，肌阵挛有所减轻，但痴呆症状无明显好转，且言语障碍加剧，一月后患者出现昏迷，半年后死亡。      经家属同意对死者进行尸检，脑组织切片发现空泡，淀粉样斑块，胶质细胞增生，神经细胞丢失，免疫组织化学染色检查PrPSc阳性，确诊为克-雅病（Creutzfeldt-Jakob disease,CJD）。   问题讨论   1.   克-雅病是什么引起？   2.   朊蛋白变构以后有什么特征？   3.   朊蛋白的变化对其功能有什么影响？

 

四、蛋白质的理化性质

（一）蛋白质的两性解离和等电点  

蛋白质是由氨基酸组成的，在其分子表面带有可解离基团，此外，在肽链两端还有游离的α-氨基和α-羧基，它既可接受质子，又可释放质子，因此蛋白质是两性电解质。溶液中蛋白质的带电状况与其所处环境的pH有关，在酸性溶液中蛋白质解离成阳离子，在碱性溶液中蛋白质解离阴离子。当蛋白质溶液在某一特定的pH条件下，蛋白质分子所带的正电荷数与负电荷数相等，即净电荷为零，此时蛋白质分子在电场中不移动，这时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。等电点时蛋白质的溶解度最小。由于不同蛋白质的氨基酸组成不同，所以都有其特定的等电点。

带电质点在电场中移动的现象称为电泳。由于蛋白质在溶液中解离成带电的颗粒，因此可以在电场中移动，移动的方向和速度取决于所带电荷性质、数目、颗粒的大小和形状等因素。由于各种蛋白质的等电点不同，所以在同一pH溶液中带电荷不同，在电场中移动的方向和速度也各不相同，根据此原理就可利用电泳的方法将混合的各种蛋白质分离开。

（二）蛋白质的胶体性质  

蛋白质颗粒直径在1～100nm，属于胶体颗粒。蛋白质溶液是胶体溶液，其稳定的因素有两个：（1）表面水化膜；蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。（2）同性电荷；在pH与pI相等时的溶液中，蛋白质带有同种电荷相互排斥，阻止蛋白质颗粒相互聚集。

（三）蛋白质沉淀 

蛋白质的沉淀作用是指在蛋白质溶液中加入适当试剂，破坏了蛋白质的水化膜或中和了其分子表面的电荷，从而使蛋白质胶体溶液变得不稳定而发生沉淀。在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵等）使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。这是由于这些盐类离子与水的亲和性大，又是强电解质，可与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质颗粒表面的水膜。有机溶剂如乙醇、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于有机溶剂和水的亲和力大，能夺取蛋白质表面的水化膜，从而使蛋白质的溶解度降低并产生沉淀。此法也可用于蛋白质的分离、纯化。但用有机溶剂来沉淀分离蛋白质时，需在低温下进行。当蛋白质溶液的pH大于其等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（如Cu²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Ag⁺等）结合形成不溶性的蛋白盐而沉淀。生物碱试剂如苦味酸、三氯乙酸等都能沉淀蛋白质。因为一般生物碱试剂都为酸性物质，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，所以能和生物碱试剂的酸根离子结合形成溶解度较小的盐类而沉淀。加热可使蛋白质变性沉淀。但加热使蛋白质变性沉淀与溶液的pH值有关，在等电点时最易沉淀，而偏酸或偏碱时，蛋白质虽加热变性也不易沉淀。

（四）蛋白质的变性  

蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是空间结构的破坏。引起蛋白质变性的因素包括物理因素和化学因素。

蛋白质变性后许多性质发生了改变：生物活性丧失；生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。某些理化性质的改变；蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低、分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。生物化学性质的改变；蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。变性的蛋白质，只要其一级结构仍完好，可在一定条件下恢复其空间结构，随之理化性质和生物学性质也重现，这称为复性，例如牛核糖核酸酶。

（五）蛋白质的颜色反应  

蛋白质分子中的肽键、苯环、酚以及分子中的某些氨基酸可与某些试剂产生颜色反应，这些颜色反应可应用于蛋白质的分析工作，定性定量地测定蛋白质。

双缩脲反应  蛋白质在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。凡含有两个或两个以上肽键结构的化合物都可有双缩脲反应

酚试剂（福林试剂）酪氨酸中的酚基能将酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，所以可用此反应来测定蛋白质含量。

茚三酮反应  蛋白质和氨基酸与水合茚三酮在水溶液中加热，可生成蓝紫色物质。首先是氨基酸被氧化分解，放出氨和二氧化碳，氨基酸生成醛，水合茚三酮则生成还原型茚三酮。在弱酸性溶液中，还原型茚三酮、氨和另一分子茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。蛋白质和氨基酸都产生蓝紫色，但颜色深浅有区别。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。

（六）紫外吸收性质 

色氨酸和酪氨酸在280nm 波长处有最大光吸收，而绝大多数蛋白质都含有色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收法是分析溶液中蛋白质含量的简便方法。

五、蛋白质组和功能蛋白质组学 

人类基因组计划的顺利实施及向功能基因组学的过渡，使生命科学研究进入了规模化。工厂化的新时代。蛋白质是生命活动的直接体现者。

蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的全套蛋白质”。蛋白质组学是指研究细胞内全部蛋白质的种类、含量、结构及其活动规律的学科。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，

功能蛋白质组学  指在特定时间。特定环境和实验条件下，基因组活跃表达的蛋白质。功能蛋白质组学注重于从局部入手，把目标定位在蛋白质群体上，在研究蛋白质群体的基础上，不仅能阐明某一群体蛋白质的功能，还能逐渐将许多不同的蛋白质群体统计组合，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质图谱。将为在细胞与分子水平上探讨人类重大疾病的机制。诊断、防治和新药开发等方面作出贡献。