基因重组
基因重组（gene recombination）：两个独立基因组内的遗传基因通过一定的途径转移到一起，经过遗传分子间的重新重组合，形成新的稳定基因组的过程。
一、 原核微生物的四种基因重组方式
原核微生物的重组方式有：转化(transformation)、转导(transduction)、接合(conjugation)和原生质体融合（protoplast fusion）。
（一）转化(transformation)
转化是细菌中最早被发现的遗传物质转移形式。l928年Griffith用肺炎链球菌对小鼠的感染实验以及10多年后Avery等体外转化过程的实现，转化因子DNA的证实，是现代生命科学发展的重要起点。
1． 转化 ：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换把它整合到自己的基因组中，从而获得了新的遗传特性的现象。
转化子（transformant）：受体细胞经复制分裂后出现了供体性状的子代。
2．感受态(competence)：细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。
3．自然转化的条件包括受体菌与外源DNA的条件。
受体菌：只有处于感受态的细菌才能吸收外源DNA实现转化。细菌的感受态是一种生理状态，涉及细菌染色体上几十个基因的功能及彼此间的相互协调。感受态因子、膜相关结合蛋白、细胞壁自溶素、核酸酶。
外源DNA ：必须具备两个基本条件，即具有高相对分子质量和同源性：
4．转化过程：主要通过3个步骤完成。
感受态细胞的建立。
DNA的结合和摄取：首先是供体双链DNA与受体细胞壁上的接受位点相结合。此反应的最初是可逆的，但随着与细胞膜蛋白的进一步作用，其与细胞壁的结合则变得十分稳定而不可逆。随后其中一条链被细胞表面上的核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条链推进受体细胞。亦发现有完整的双链被摄取的情况，如革兰氏阴性菌——嗜血杆菌。
转化因子与染色体重组 当单链进入受体细胞后，便与双链结构的受体染色体DNA同源片段发生交换重组。即与受体菌DNA整合，形成供体DNA--受体DNA复合物，再通过DNA复制和细胞分裂而表现出转化性状，形成转化子。
能够发生转化的微生物有：肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属和根瘤菌属等20多种菌。
(二)转导 (transduction)
1952年Zinder和Lederberg在验证鼠伤寒沙门氏菌是否也存在接合现象时发现了转导现象。
通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新性状的受体细胞，称为转导子(transductant)。携带供体部分遗传物质(DNA片段)的噬菌体称为转导噬菌体。在噬菌体内仅含有供体菌DNA的称为完全缺陷噬茵体；在噬菌体内同时含有供体DNA和噬菌体DNA的称为部分缺陷噬菌体(部分噬菌体DNA被供体DNA所替换)。根据噬菌体和转导DNA产生途径的不同，可将转导分为普遍性转导和局限性转导。
1．普遍性转导(general transduction)
通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片断的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。
普遍性转导的机制：当噬菌体侵染敏感细菌并在细菌内大量复制增殖时，亦把寄主DNA降解为许多小的片段，在装配时，少数噬菌体(10-6一10-8)错误地包装了宿主的DNA片段并能形成“噬菌体”，这种噬菌体称普遍性转导噬菌体(为完全缺陷噬菌体)。随着细菌的裂解，转导噬菌体也被大量释放。当这些转导噬菌体再次侵染受体菌时，其中的供体DNA片段被注入受体菌。普遍性转导的三种结果：
1）完全普遍性转导：如果该DNA片段能与受体菌DNA同源区段配对，通过遗传物质的双交换而进行基因重组并形成稳定的转导子，称完全普遍性转导。如鼠伤寒沙门氏菌的P22噬菌体、大肠杆菌的P1噬菌体和枯草芽孢杆菌的PBS1和SP10等噬菌体中都能进行完全转导。
2）流产转导：如果该DNA片断不能与受体菌DNA进行交换、整合和复制，只以游离和稳定的状态存在，而仅进行转录、转译和性状表达，称流产转导。发生流产转导的细胞在其进行分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因转录、转译而形成的少量产物--酶，因此在表型上仍可出现轻微的供体菌特征，每经分裂一次，就受到一次“稀释”。所以能在选择培养基上形成微小菌落就成了流成转导子的特点。
1） 外源DNA被降解，转导失败。
2．局限性转导(specialized transduction)
通过部分缺陷噬的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象）。转导后获得了供体部分遗传特性的重组受体细胞称为局限转导子。
局限性转导的机制：温和噬菌体感染供体细菌后整合到细菌染色体的特定位点上，宿主细胞发生溶源化。当噬菌体脱离宿主染色体的过程中，位于前噬菌体二侧的少数宿主基因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上形成部分缺陷的温和噬菌体，这种部分缺陷的温和噬菌体再感染受体菌，并把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中。
局限性转导与普遍性转导的主要区别：
a） 局限性转导被转导的基因与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起复制、包装以及被导入受体细胞中；而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。
c） 局限性转导颗粒携带特定的染色体片段（一般位于噬菌体整合位点两侧），并将固定的个别基因导入受体；而普遍性转导可携带宿主的任何基因，具有随机性。
c）局限性转导中特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带，需要紫外线等因素诱导溶源菌。
(三)接合(conjugation)1.概念：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的核基因组片段传递给后者，使其获得若干新遗传性状的现象。
Iederberg和Tatum于1946年设计了一个有名的实验，才证明了原核生物的接合现象。他们筛选出了两种不同营养缺陷型的大肠杆菌K12突变株，其中A菌株是met-、bio-，B菌株是thr-、Leu-，将它们在完全培养基上混合培养后，再涂布于基本培养基上。结果发现，在基本培养基上出现了met+、bi0+、thr+、1eu+的原养型菌落(约为10-7)，而分别涂布的两种亲本菌株对照组都不出现任何菌落。进一步的实验证实，上述遗传重组的形成，是两个亲本细胞接合以后发生基因重组的结果。在细菌中，接合现象发研究最清楚的是E.coli，研究发现E.coli是有性别分化的，决定性别的是一种质粒，即F因子。
2. 机制：接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导的。F因子上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。
3、大肠杆菌的四种接合型菌株及接合杂交
现在根据E.coli细胞中是否存在F因子以及在细胞中的存在方式不同，可把大肠杆菌分成以下四种类型。
1）F-菌株：不含F因子，无相当数量的性菌毛。
2）F+菌株：F因子以游离状态存在，可独立于染色体进行自主复制。一般有1-4个，且细胞表面有相当数量的性菌毛。
F+×F- 接合：通过F+菌产生的性菌毛把两者连接在一起，并在细胞间形成胞质桥(或称接管)，F因子通过胞质桥进入受体细胞，使重组体从F-变成了F+菌。其主要过程是，F因子的一条DNA单链断裂(在特定位点上)、解链，并单向转移进入受体细胞，在此作为模板而形成新的F因子；另一条在供体细胞内的DNA链也成为模板并以滚环模型形式复制；最终供体菌及受体菌均成为F+菌。
3）高频重组菌株（Hfr菌株）：大肠杆菌的F因子插入到染色体DNA上，接合转移时，就可把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，称为高频重组菌株，有性菌毛。发现Hfr与F-菌重组的频率要比F+菌与F-菌重组的频率高得多。
Hfr×F-杂交：Hfr菌株染色体向F-菌株转移的过程与F+相似（滚环模型），只是进入F-的单链染色体片段双链化后，形成部分合子，两者的同源区段配对，经双交换后，才发生重组。供体菌整段染色体通过性菌毛转移致F-细胞，约需100min。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。Hfr×F-杂交后，受体细胞多数仍然是F-，而其它遗传性状的重组频率却很高。
4）F′菌株：Hfr菌株的F因子因不正常切割而脱离染色体，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。含F′因子的菌株，称F′菌株。有性菌毛。
F′×F-杂交：F′与F-的接合过程中给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞，形成一种部分二倍体，叫F因子转导，也叫性导。
四种菌株之间的转换关系：
（四）原生质体融合（protoplast fusion）
1．概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（fusant）的过程.
2．优点：能进行原生质体融合的细胞是极其广泛的，不仅包括原核生物，而且还包括各种真核细胞。原生质体融合的优越性在于：
1）它打破了微生物的种属界限，可以实现远缘菌株的基因重组。1981年Yamada有PEG诱导酵母原生质体与细菌细胞成功的融合，并使其固氮作用或光合作用实现了不稳定的表达。
2）原生质融合可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组体的机会，有利于提高育种速度。此外原生质体融合技术还可用于研究细胞质遗传、核质关系等问题，因此原生质体融合技术在生产实践及理论研究上均有具有重要意义。
一、 真核微生物基因重组
在真核微生物中，基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。
准性杂交（parasexual hybridization）
有一类不产生有性孢子的丝状真菌，不经过减数裂就能导致基因重组的生殖过程称为准性生殖。1953年Pontecorvo等在研究构巢曲霉时首先发现准性生殖现象。
准性生殖过程：
1）菌丝联结
2）形成异核体
3）核配
4）体细胞交换和单倍体化,形成单倍体杂合子
第四节 基因工程
一、基因工程：
指用人为的方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在适当的条件下用适当的酶切割后，把它与载体DNA分子连接起来形成具有自我复制能力的DNA分子——复制子，并将它转移到宿主细胞中进行扩增和表达。
二、基因工程的基本操作
三、教学参考
微生物学与基因工程的关系：
①基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；
②基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；
③将外源DNA导入宿主细胞的人工转化方法，是在微生物自然转化现象的基础上发展起来的
④微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；
⑤为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；
⑥有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。
⑦微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；
第五节、分子遗传学技术在环境工程中的应用
1、多功能超级细菌的构建
假单孢菌：降解芳烃、萜烃、多环芳烃的质粒转移到能降解脂肪烃的假单孢菌内
解烷抗汞质粒的构建：噬油假单孢菌OCT质粒（降解烷烃）转移到恶臭假单胞菌（抗汞）
脱色工程菌：假单胞菌
2、环境污染降解基因的PCR检测技术
从氯代芳烃类化合物污染的环境中分离降解菌株，克隆污染物降解基因
3、荧光原位杂交（FISH)检测活性污泥中的硝化细菌
4、变性梯度凝胶电泳（DGGE)分析环境样品中的微生物多样性
土壤、水样、底泥、生物膜等微生物群落的多样性
