第一节 微生物的生长繁殖
一、微生物生长繁殖的概念
生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。
繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。
生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。高等生物: 这两个过程可以明显分开;单细胞的生物:两个过程是紧密联系又很难划分，在微生物学中提到的“生长”: 一般均指群体生长。群体生长=个体生长 + 个体繁殖，即群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程
二、微生物生长的测定
微生物生物情况可以通过测定单位时间里微生物数量或生物量的变化来评价。
一） 测生长量
1．重量法
以干重、湿重直接衡量微生物群体的生长量；它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
2、比浊法
比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此在一定波长下(450-650nm)，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。
二、计繁殖数量
通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）。
1、培养平板菌落计数法（clony－counting methods）
又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。
浇注平板法（pour plate）：将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数。
涂布平板法（spread plate）：将稀释的菌液取0.2m1加到已制备好的平板上，然后用无菌涂棒将菌液涂布整个平板表面，放入适宜温度下培养，计算菌落数，再按上公式计算出每毫升原菌液的所含活菌总数。
采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果；样品要充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；含菌样品稀释度要合适，一般每个平板菌落数为30-300CFU为宜，同一稀释度三个以上重复,取平均值。
菌落形成单位（colony forming units，CFU）：在平板计数法中，一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以一般用菌落形成单位来表示细菌数，而不是直接表示为细胞数，即细菌数记为：CFU/mL。
2、显微镜直接计数法
这类方法是利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1mm2和高o.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成。
将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算4-5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×l0000×稀释倍数
显微镜直接计数法缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；
3、吖啶橙荧光显微镜直接计数法
•吖啶橙分子与细胞中的核酸反应，在荧光显微镜下（发射出的光为450-490nm）根据细胞和核酸的不同生理状态而发出黄色或红色的荧光，如生长缓慢的细菌发黄色荧光，而生长活跃的细菌或死亡的细菌发红色，可进行直接计数。
4、膜过滤培养法
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。
5、最大可能数法（液体稀释法）The most probable number method
主要适用于进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。
三、研究微生物生长的方法
（一）分批培养
分批培养概念：将定量的微生物接种到封闭的具有定量培养基的容器中，保持一定的温度、pH、DO，微生物进行生长繁殖。
（二）连续培养
一方面连续进料，另一方面又连续出料。
原理：进料=补足营养(“污染物”)
出料=稀释菌浓度、毒物浓度
它又分为两种：
1)恒浊连续培养：主要是通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。菌液浓度大小通过光电系统调节稀释率来维持菌数恒定，此种培养方式一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业，从而获得更好的经济效益。
2)恒化连续培养。是在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。培养基中的某种营养物质通常是作为细菌比生长速率的控制因子，这类因子一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质。恒化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。
三、微生物的生长曲线（分批培养）
将少量细菌的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。
一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。
1．停滞期 (1ag phase)
将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。
特点：分裂迟缓、代谢活跃。生长速度常数为零，胞内的RNA、蛋白质等物质含量有所增加，相对地此时的细胞体最大，对外界不良条件反应敏感。说明细菌并不是处于完全静止的状态。
产生迟缓期的原因，微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。
迟缓期的长短：与菌种的遗传性、菌龄、接种量以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。
缩短迟缓期的措施：①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；②利用对数生长期的细胞作为“种子”； ③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。
2．对数期(log phase)
又称指数生长期(exponential Phase)。细菌经过迟缓期进入对数生长期，并以最大的速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增加，而且细菌内各成分按比例有规律地增加，此时期内的细菌生长是平衡生长。对数生长期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定，大小比较一致，生活力强，因而它广泛地在生产上用作“种子”和在科研上作为理想的实验材料。
繁殖代数（n）:在一定时间内细菌分裂繁殖的次数。
代时（ Generation time，G）：细菌个体生长时，每个细胞分裂繁殖一代所需的时间。
生长速率常数（growth rate constant ,R）：细菌单位时间（h）分裂的次数。
倍增时间（Doubling time）：在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间。
以二分裂的细菌为代表，假设细菌培养体在对数期to时的总菌数为No，那么到ｔ时的菌数Nt＝No×2n；式中ｎ为to到ｔ这段时间内细菌的繁殖代数。如果用G来表示世代时间(或倍增时间):即群体细胞数量增加一倍需要的时间，则：
------------------G＝(t-to)/n (1)
----∵------------Nt＝No×2n
----∴------------logNt＝ｎlog2＋logNo
--------------ｎ＝〔logNt－logNo〕/ log2 = （logNt- logN0）/0.301
G=（t1 –t0））/n， R=1/G
----通过实验可测得No、Nt和时间ｔo、ｔ，可计算出供试微生物的世代时间G。
影响微生物增代时间（代时）的因素：1）菌种：不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；如大肠杆菌在37℃的代时是20min左右，纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。2）营养成分：在营养丰富的培养基中生长代时短；3）营养物浓度：在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；4）温度：在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。
3．稳定期(stationary phase)
由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量)，结束对数生长期，进入稳定生长期。
特点：活细菌数最高并维持，生长速率稳定为零；储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等；发酵过程积累代谢产物的重要阶段；某些放线菌抗生素的大量形成时期。
延长稳定期的方法：补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等可以延长稳定生长期，获得更多的菌体物质或代谢产物。
4．衰亡期(decline或death Phase)
营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐步减少，标志进入衰亡期。该时期细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶。生或释放一些产物，如氨基酸、外肽酶或抗生素等；细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。
此外，不同的微生物，甚至同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH4+等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力(例如乳糖或NO3-等)。前者通常称为速效碳源(或氮源)，后者称为迟效碳源(或氮源)。当培养基中同时含有这两类碳源(或氮源)时，微生物在生长过程中会产生二次生长现象。
