外植体的采集、处理、灭菌和接种

一实训内容    

外植体的采集、处理、灭菌和接种

二实训目的

熟悉外植体材料的采集方法和预处理，掌握其消毒和接种方法。 

三实训材料  

植物材料、70%酒精、表面消毒剂、无菌水、洗衣粉、灭好菌的培养基、Tween-80、镊子、解剖刀、酒精灯等。

四方法与步骤：

1外植体的采集  

一般在春夏晴天中午时分，从优良品种的健壮植株上，选取旺盛生长的植物材料。

2植物材料的预处理

除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，视植物材料清洁程度置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时。如果污染较重，可再用洗衣粉水等浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉水。 

3净工作台、接种人员等无菌操作方法  

将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少20 min后关掉紫外灯。操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，以后各步均须在超净工作台上操作。

4植物材料的灭菌处理  

首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100 mL消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5 cm），开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。 倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。

5接种  

逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于超净工作台的适当位置。在完成了该第一只培养容器的外植体接种操作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭菌，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台台面的灭菌，直至全部完成，并做好标记。

五训练要求

能正确选取外植体材料，能根据外植体污染程度选择预处理方法和灭菌方法、时间；能准确进行超净工作台、操作人员的无菌操作；能正确接种和作标记。

六实训报告

写出实训报告，内容包括外植体选择、预处理和灭菌方法，超净工作台、操作人员的无菌操作方法等。

七考核标准

能准确选取外植体20分

能正确选取预处理方法20分

能准确进行超净工作台、操作人员无菌操作     10分

能正确进行外植体灭菌20分

能正确接种                                  20分

能正确进行标记 10分