腺病毒转染细胞步骤
一．病毒包装
1.293A细胞在10 cm培养皿中培养至80-90%融合时，接种6 cm培养皿。
2.倾去培养液，用1mL D-Hank solution洗涤细胞两次。
3.加入1 mL Trypsin-EDTA solution，混匀后,37 °C放置2-3分钟。
4.小心吸去胰酶溶液，加入2mL含10%FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
5.将0.5 mL细胞悬液接种150px培养皿，加入4 mL含10%FBS的DMEM培养液，混匀后37 °C、5%CO2培养过夜。
6.在一只无菌的1.5 mL离心管中加入0.5mL无血清DMEM，按比例加入含目的序列的穿梭质粒和骨架质粒，混匀，取另一支无菌的1.5 mL离心管，加入0.5mL无血清DMEM，再加入10-15 RNAi-Mate,混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20-25分钟。
7.除去6 cm培养皿中的培养液,加入3 mL无血清的DMEM培养液。
8.将转染混合物逐滴加入6 cm培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37 °C、5%CO2培养箱中温育4-6小时。
9.吸弃转染液，加入4 mL含10%FBS的DMEM培养液，37°C、5%CO2继续培养。
二.病毒收集
1.孵育7天后，检查是否存在空斑。如果可以收获(剩余>50%的细胞)，然后收集病毒裂解原液。如果不能收获，添加1 mL完全培养基,继续在5%CO2、37°C下孵育。
2.第10天，检查是否存在空斑,如果可以收获(剩余>50%的细胞)，然后收集病毒裂解原液。如果不能收获，添加1 mL完全培养基，继续在5%CO2、37 °C下孵育，持续检查是否存在空斑，但不要超过15天。
3.用5或10mL的无菌吸管将含腺病毒的细胞从皿上吹下，将细胞和培养基转移到一个15mL管中，必要时使用细胞刮。
4.37 °C水浴和干冰-甲醇浴，每次10分钟,反复冻融三次释放病毒。
5.室温下，细胞溶胞产物在台式离心机中以3000 rpm离心15分钟以沉淀细胞碎片。
6.分装并-80 °C储存病毒裂解原液(初始病毒原料)。
三.病毒扩增
1.感染前一天，按3-5*106个细胞铺一个375px培养皿。
2.加入50%的上述病毒裂解原液至培养基,建议使用大于>0.5PFU(空斑形成单位)或足够的病毒使细胞在48 h内表现细胞病变效应(CPEs)。
3.在感染24-48小时，每天两次显微镜下检查细胞病变效应(CPE)，当CPE是接近完成(即大多数细胞呈葡萄球状，但尚未脱离瓶底)时，用移液管将感染的细胞从皿上吹到培养基中，收获细胞。
4.合并感染的细胞和培养基，在1000 g下离心5分钟沉淀细胞，吸弃上清液，用培养基或10 mM Tris，pH8.0，100 mM NaCl重悬细胞(每15 cm培养皿0.25-0.5mL)。
5.反复冻融三次，释放腺病毒，3000 g 10分钟离心，以沉淀细胞碎片，弃去沉淀，保存病毒上清物。
6.病毒上清可以储存在-80 °C 或立即纯化。
四.病毒纯化
1.病毒纯化采用CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，CsCl梯度的制备方法如下:加入2.0mL密度为1.40 g/mL的CsCl溶液，然后缓慢加入3.0mL密度为1.30 g/mL的CsCl溶液，再加入5mL的病毒悬浮液。
2.20000 rpm，室温离心2小时。
3.收集密度在1.30 g/mL和1.40g/mL之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10 mM的EDTA-Na2煮沸10 min)在透析缓冲液(50g蔗糖，10 mL 1 M Tis-HCL，PH8.0，2mL 1 M MgCl2定容至1L)中。
4.4 ℃搅拌透析过夜，中间换一次透析液，收集病毒。
五.病毒保存
1.一周内使用则置于4 °C冰箱保存。
2.如需长时间存放需置于-80 °C甚至液氮保存。
