用粘粒载体构建山羊基因组文库
1.载体的制备
25 μg SuperCos1，按照试剂盒说明书介绍的操作方法，用XbaⅠ（9 U/μg）完全酶解线性化，经牛小肠碱性磷酸酶（1 U/μg）去磷酸处理，再用BamHⅠ(5 U/μg）完全消化为1.1 kb和6.7 kb的两臂。
2.山羊基因组DNA制备
2g雌性萨能奶山羊4月龄胎儿组织块，在-80 ℃条件下取出，碾成粉末，PBS洗1次，加入10 mL裂解液（10 mmol/L Tis·Cl，pH 8.0; 100 mmol/L NaCl; 25 mmol/L EDTA，pH 8.0; 0.5%SDS），10000 r/min匀浆1 min，加入过量蛋白酶K粉末，50 ℃温育4-6 h，每20 min轻轻颠倒混匀1次，待溶液澄清、透明后升温至70 ℃，加入4 μL RNA酶（100 mg/mL）混匀，温育30 min。冷却至室温后加入15 mL 变性缓冲液（80%Formamide; 0.8 mol/L NaCl; 20 mmol/LTis·Cl，pH 8.0），15 ℃静置12 h后倒入透析袋中，对5 L 0.1 mol/L NaCl 、20 mmol/L Tis·Cl （pH8.0）、10 mmol/L EDTA（pH8.0）透析3次，每次12 h，然后再对5 L 10 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tis·Cl（pH8.0）、0.5 mmol/L EDTA（pH8.0）透析6次，每次12 h。测得OD260/OD280=1.76，脉冲电泳检查大小。
3.插入片段的制备
a. 建立基因组DNA不完全酶切条件
b. 分离40 kb左右的片段 按最适条件放大，消化100 μg基因组DNA，然后用牛小肠碱性磷酸酶脱磷，经10%-40%蔗糖线性梯度离心，连续分部收集在24个500 μL EP管中（每管480 μL），取3、5、7……21号管走脉冲电泳，合并13-16管，透析去蔗糖，并浓缩、抽提。
4.连接与包装
载体与插入片段比例分别为12.5、15.0和1：10.0，16 ℃条件下2000 U T4DNA连接酶连接过夜，用GigapackⅢ XL包装蛋白体外包装。
5.转染
按照试剂盒说明书介绍的方法，将包装产物转染E.coli XL-Blue MR，菌落用LB培养液（含50 μg/mL）氨苄青霉素）冲洗收集，菌液配成15%的甘油溶液，混匀后用1.5 mL 的EP管分装，-80 ℃冷冻保存。
6.重组子的鉴定
随机接种120个单菌落，培养过夜，采用碱裂解法提取质粒，0.6%琼脂糖凝胶电泳检查阳性克隆数，部分粘粒用EcoRⅠ消化，电泳检查片
段大小。
7.PCR分析
根据人、山羊、绵羊的某些基因设计5对PCR引物，每对引物设3个反应管，阳性对照以基因组DNA为模板，检查管以粘粒文库DNA为模板，阴性对照管不加模板。
