基于核酸外切酶I的适配体荧光传感器检测人尿液中的Hg2+
1、包被亲和素:亲和素用碳酸盐缓冲液稀释成适当浓度,包被微孔板(100μL/孔),4℃放置12h后,用PBST缓冲溶液清洗。最后用1% BSA封闭1h,PBST洗涤3次。
2、DNA在微孔板上的固定:亲和素包被的微孔板中,每孔加入100μL检测DNA的PBS溶液,37℃摇床摇振反应2h,通过DNA 5'端的生物素和亲和素的特异相互作用,DNA固定到亲和素包被的微孔板上。PBST洗涤3次,200 μL/孔。然后加1% BSA封闭1h,PBST洗涤3次。包被的DNA微孔板立即用于下步测试。
3、Hg2+的定量检测:
(2)DNA识别反应:Hg2+标准溶液用结合缓冲液稀释成系列浓度,分别加入到包被检测DNA的微孔板中,每孔100μL,室温孵育40min使DNA和Hg 2+充分反应。接着在每孔中加入1.2μLExoⅠ(5 U/μL)和11μL 10×ExoⅠ缓冲液,37℃孵育30 min; 倾去反应液,用PBST缓冲液洗涤3次,200μL/孔。
(1)荧光测定:在识别反应后的微孔板各孔中加入100 μL的5×SG的溶液,室温孵育10min。用荧光酶标仪测定荧光光谱。激发波长480nm,发射波长520nm。加入Hg2+前,测得荧光强度I0; 加入Hg 2+之后,测得荧光强度IF,以IF定量分析Hg 2+浓度,绘制工作曲线。
4、实际样品测定:
(1)添加回收实验:4℃保存的尿样,离心取上层清夜,向样品中分别添加2.0,10.0和50.0nmol/L的Hg 2+标准液,4℃放置过夜后,再次离心,取上层清夜。用建立的方法测定荧光强度。
(2)人尿样总汞检测:先将尿样中其它形式的汞转变成Hg 2+,在10mL尿液中,加入浓HNO3 2mL及6% KMnO4溶液1mL,加热回流2h; 待KMnO4溶液的颜色消失,将温度降低到60℃以下,然后加入0.1mL KMnO4溶液,再加热溶液; 最后用碱将溶液调至pH8.0,并浓缩至原体积。然后按照建立的方法检测。
https://www.chemicalbook.com/NewsInfo_7023.htm
T5核酸外切酶的制备