碱性磷酸酶的制备及比活力测定
一、碱性磷酸酶的制备
1、25g牡蛎加入50mL预先冷却的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.5，含0.1mol/L NaCl），于高速组织捣粹机匀浆1min，于冰箱4℃放置1h左右进行抽提。
2、匀浆液冷冻离心，4000r/m 20min，收集离心上清液，并量体积。（留3mL上清液，待测酶的比活力。）
3、在上清液中缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100mL加入20.9g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1h左右。冷冻离心，4500r/m 20min，收集离心上清液，并量体积。（留3mL上清液，待测酶的比活力。）
4、在3步骤上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.70饱和度（100mL加入23.8g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置1-2h。冷冻离心，4500r/m 20min，收集沉淀物。
5、将沉淀溶于5mL 0.01mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.5，含0.1mol/L NaCl）。装入透析袋，对0.01mol/L Tris-HClpH7.5缓冲液透析平衡，至无SO42-被检测出为止。冷冻离心，25000r/m 30min，收集离心上清液，并量体积，得到粗酶液。
二、碱性磷酸酶比活力测定（对-硝基苯磷酸二钠法）
1、对硝基苯酚标准曲线的制作：先配置一组含有0μmol、0.05μmol、0.10μmol、0.15μmol、0.20μmol、0.25μmol、0.30μmol、0.35μmol的pNP标准溶液，再加入1.0ml Na2CO3-NaHCO3溶液，再加入0.2mL 20mmol/L MgCl2溶液，再加入2.0mL 0.1mol/L NaOH溶液，混匀后在405nm下测定吸光度值。以pNP溶液mol数为横坐标，吸光度值为纵坐标制作标准曲线，拟合出相关曲线方程。
2、酶活力的测定：在样品中加入0.2mL5mM pNPP溶液，再加入1.0mL Na2CO3-NaHCO3溶液，再加入0.2mL 20mmol/L MgCl2溶液，再加入0.50mL水，混匀，在37℃下保持5min。加入0.1mL酶液，37℃下反应10min。在各管中加入2.0mL0.1mol/L NaOH溶液。空白对照管补加0.1mL相应酶液。测定405nm下的吸光度值，用空白管调零。
3、蛋白浓度测定（双缩脲法）：分离提取的三步酶制剂测定时用Tris-HCl缓冲液稀释5倍。
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血清碱性磷酸酶,它有哪些临床意义
