DNA连接酶
一、实验原理
DNA 连接酶是生物体内重要的酶，其所催化的反应在DNA的复制和修复过程中起着重要的作用。DNA连接酶分为两大类:一类是利用ATP 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖ATP的DNA 连接酶，另一类是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖NAD* 的DNA 连接酶。
DNA连接酶主要用于基因工程，将由限制性核酸内切酶“剪”出的粘性末端重新组合，故也称“基因针线”。就是连接DNA链一个碱基3‘-OH末端和它相邻碱基的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两个相邻的碱基连接起来。
基因工程中，大肠杆菌连接酶只连接黏性末端，而T4连接酶既可连接黏性末端，又可连接平末端。
二、实验步骤
（1）、DNA连接所需材料及试剂：
1.苯酚、氯仿、TE（pH 7.6）溶液。
2.10×T4 DNA连接酶缓冲液（该缓冲液应分成小部分，并在-20°C下保存）：200mMTris-HCl（pH 7.6）；50mMMgCl2; 50mM二硫代苄糖醇。
3.500μl/ ml BSA（可用或不可用）。
4.5mMATP。
5.混凝剂：聚乙二醇、六氯化铵。
（2）、DNA连接步骤
（一）、预处理
1.将以下溶液添加到无菌的离心管中：
1）在体积为10μl的反应系统中：取50-100 ng的载体并添加一定比例的外源DNA分子（通常线性载体DNA分子与外源DNA分子的摩尔数为1：1至1 ：5）组成ddH2O至8μl。
2）轻轻混合，离心一点，然后在45°C水浴中融化重新连续的粘性末端5分钟，然后迅速将其转移到冰浴中。
3）加入1μl含ATP的10x缓冲液（T4 DNA连接酶的适当单位），并用ddH2O补足至10μl。
2.盖上管盖，混合均匀，并在台式离心机上离心五秒钟。
3.在12℃下碳化连接反应。
4.反应后储存在-20℃。
5.建立另外两个对照反应，其中仅包含（1）个质粒载体；（2）仅外源DNA片段。如果外源DNA的量不足，则每个连接反应可以使用50-100ng质粒DNA，并且可以同时添加更多的外源DNA，同时保持连接反应量不超过10μl。可以使用至少三种不同的方法来确定T4噬菌体DNA连接酶的活性。
（二）、平端连接（以20ul消化后的系统为例）
1.如果要填充或切平，请先将样品放入70度水浴中10分钟，然后将系统扩大至50ul。根据说明添加所需的klenow缓冲液和酶，BSA等。
2.在室温下反应10分钟后，将反应物放入37度水浴中，然后加入T4聚合酶反应5分钟。
3.用于凝胶回收处理的载体或杂质。
4. CIAP处理。
5.苯酚氯仿纯化，最后乙醇回收。
6.连接反应。
