质粒DNA的提取与纯化
一、仪器和材料
恒温振荡培养箱,高速冷冻离心机,旋涡振荡器,水浴锅，1.5mL离心管，
50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，
电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管等。
菌体: E.coli DH5a受体菌，具有Amp'标记的质粒pUC19。
二、实验试剂
LB培养基，抗生素(氨苄青霉素)，溶液I，溶液II，溶液II，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇(PCI)混合液，预冷无水乙醇，TAE 电泳缓冲液(10X)，上样缓冲液(6X),琼脂糖，溴化乙锭(EB), DNA相对分子质量标准物DNA Marker λ/HinlII, 5mol/L pH 5. 2的醋酸钠。
三、实验步骤
1.菌体培养
(1) 配制40ml液体LB培养基(加入5%葡萄糖)、100mL固体LB培养基、并准备足量的移液管、200μ 1微量移液器头、1000μL微量移液器头、50mL离心管、1. 5mL离心管，灭菌备用。
(2) 向液体LB培养基移取32μ 1氨苄青得素，混合均匀。
(3) 将提前活化的E. coli DH5a 受体菌,接种于液体LB培养基中。将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16小时。
2.质粒DNA的提取
(1) 称量50mL离心管重量W1，取30mL菌液于已称重的50mL离心管中，配平后6000r/min离心5min。
(2)弃上清液，向离心管中加入5mL溶液I，涡旋振荡，6000r/min离心5min。
(3) 弃上清并称重W2，求W=W2-W1。
(4) 按照1.0mL/100mg菌体的量加入溶液I，充分涡旋振荡，冰浴5min，再按照2. 0mL/100mg菌体的量加入溶液II，温和颠倒混匀，冰浴2min，然后再按照1. 5mL/100mg菌体的量加入溶液II,温和颠倒混匀，冰浴10min,平衡后12000r/min 离心15min。
(5) 取上清液至新50mL离心管内，记录体积，加入两倍体积的冰乙醇，混匀后在-20℃环境下保存30min。取出后12000r/min离心15min,弃上清，加入5mL 70%乙醇，12000r/min离心5min,弃上清，加入5mL 70%乙醇，12000r/min 离心5min, 弃上清，37℃放置5-10min。
(6) 取出离心管，加入1mLTE溶液得到粗提物，加入RNase A液，使溶液浓度为150 μg/mL，37℃保存60-120min。
3.质粒DNA的纯化:
(1) 取500μl粗提物于1. 5mL离心管中，加入等体积的Tris饱和酚，混匀，12000r/min 离心10min。.
(2) 转移上清液(体积V1)至新管，加入等V的酚:氯仿:异戊醇溶液，混匀，12000r/min 离心5min。
(3) 转移上清(体积V2) 至新管，加入等V2的氯仿:异戊醇溶液，混匀，12000r/min 离心5min。
(4)转移上清液(体积V3)至新管，加入1/10 V3的3M NaAc 溶液(pH5.2)，再加入2V4(V4=V3 + 1/10V3)的冰乙醇，混匀，-20℃保存30-60min,取出后12000r/min离心15min。
(5) 弃上清，加入500μL 70%乙醇，10000r/min 离心2min, 再加入500μL 70%乙醇，10000r/min 离心2min，37°C保存5- 10min。
(6)取出离心管，向只离心管中加入25μL TE溶液，溶解沉淀后，转移入另- -只离心管中，再取25μL TE溶液加入第- - 只离心管中，溶解后再移入另一只离心管中，得到50μL 纯化质粒DNA。
4.DNA纯度检测
(1) 取40mL TAE (1X)于300mL锥形瓶中，加入0.4g琼脂糖，放入微波炉内使其熔化，60"C时倒入准备好的制胶槽中。
(2) 取5.0μL纯化DNA加入1.0μL上样缓冲液，混合，进行点样。
(3)点样完毕后，100V，200mA 条件下电泳30min。
(4) 电泳完毕后，进行EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。
