水稻的转基因实验步骤
一、水稻组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）
1. 消毒
取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子按以下步骤消毒：
1）将种子放到100 mL 无菌三角瓶中倒入70％的酒精消毒1min；
2）倒去酒精，加入100mL 3％的次氯酸钠溶液，放入摇床振荡60 min；
3）倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30 min。
2. 诱导与继代培养（以下步骤需要无菌操作）
1） 种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；
2） 操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，培养10-15天
3） 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色、致密呈球状），在26℃培养箱继代培养两周（继代两次）。（没有任何脱落可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱）
二、预培养
将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃ 暗培养4天。预培养基碳源为20克蔗糖 + 20 mL 50％葡萄糖（115℃灭菌30min），乙酰丁香酮（AS）浓度为100
(每毫升培养液中加入100mM的AS 1微升)。
三、农杆菌培养
把-70℃保存的菌种首先用含125g/L的壮观霉素、50mg/L利福平的YEP液体培养基，在26-28℃，150r/min振荡3-4培养16-18小时，活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第二天，用含125g/L 的壮观霉素、50mg/L利福平的YEP固体培养基，划线接种农杆菌菌株，28℃静止培养2-3天，3天后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体，培养基或者AAM培养基，28℃振荡培养3-4小时。分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调整至0.5-1.0 OD600。
四、感菌与共培养
1）将预培养后的愈伤组织接入100mL三角瓶中，加入调制好的农杆菌悬浮液浸染30min，期间摇动数次；
2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌滤纸上吸干表面菌液（30-40min）；
3）将愈伤组织置于共培养基上（共培养基上面垫上一层225px无菌滤纸）。19-20℃暗培养三天。
五、愈伤组织的抗生素筛选
将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗四次，然后加入无菌水浸泡10min，使愈伤组织内部的菌体游离出来；倒去洗液，再用含400mg/L头孢的无菌水浸泡20min，最后置于无菌滤纸上沥干3h。
第一轮筛选：将沥干的愈伤组织转入含400mg/L羧苄青霉素和400mg/L的头孢霉素的选择培养基（没有选择压力）上，26℃暗培养5-7天；然后将愈伤组织转到含400mg/L羧苄青霉素、400mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的培养基上进行选择，26℃，暗培养，两周一次，培养两次。
六、抗性愈伤组织的诱导分化和生根
1） 将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，26℃，暗培养5-7天；
2） 预分化培养的抗性愈伤组织转入分化培养基，26℃，2000Lx光照培养，再生转基因植株。
3） 待小苗长到3-125px；转入生根培养基上发根。
4） 将根系健壮的植株移入盆中，凉棚过度3-5天；然后转移到自然条件下生长，直至成熟。
七、转化苗的检测验证
材料准备：瞬时表达检测取浸染后的愈伤组织；稳定表达取分化前的愈伤组织
叶片。幼根等徒手切片（或者剪成小块、小片）。
1） GUS检测将准备好的材料浸泡在染液中，于37℃保温过夜。
2） GFP检测：将材料放在共聚焦显微镜下观察成像；
3） PCR检测：设计潮霉素抗性基因引物HYG-F。PCR反应条件为：95℃变性5min，55℃退火2min，72℃保温10min，反应结束后，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。
