Sanger法测序
一、实验原理
Sanger法测序是第一代基因测序，它利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或者C处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、 C、G 结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。
双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的由来
缺少3'位的羟基的ddNTP结合到DNA链上，会使得后面的单脱氧核苷酸（dNTP）无法再聚合上来，致使聚合反应终止。
一、实验步骤（ABI公司BigDye测序方法）
ABI公司根据双脱氧法进一步开发出，荧光标记的双脱氧法测序试剂盒即BigDyeTM试剂再结合毛细管电泳生产出ABI 3730和 ABI 3500等测序仪。
1. 加入bigdye试剂（包含四种带荧光标记的ddNTP、四种dNTP、DNA聚合酶、镁离子、ph缓冲液等。）进行聚合反应。
在进行聚合反应时，有可能结合上ddNTP且终止反应，也有可能结合上正常dNTP正常反应，直到结合上ddNTP终止反应。反应结束生成长短不一的含有荧光标记的DNA片段混合物（荧光颜色（代表的碱基）与模板的碱基有互补对应的关系）
2. 过滤混合物，去除ddNTP等其他杂质，只留下长短不一的DNA片段。
3. 上机测序
1） 先在长的中空的玻璃毛细管中注入丙烯酰胺溶液，用紫外光照射丙烯酰胺溶液发生聚合反应变成聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶对于在其中电泳的核酸有分离作用,短的片段在其中电泳得快，长的片段在其中电泳的慢。
把DNA片段混合物，加到有聚丙烯酰胺凝胶的毛细管的一段，在毛细管的两端加上高电压，DNA片段就在电场的作用下，从负极向正极电泳。
3）在毛细管正极的末端，用激光进行照射，并用分光的光学传感器把不同颜色的荧光强度记录下来。每个DNA片段在经过激光点扫描时，它上面带有的荧光基团就会发出特定颜色的荧光。
峰
越高、越尖，与别的峰的交错越少，则这个碱基判读准确性越好。
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助力抗疫填补空白，首台国产Sanger测序仪发布！
多重呼吸道病原体核酸检测是新冠肺炎确诊和防疫的重要手段之一，可将新冠病毒与流感病毒等其他常见呼吸道病毒有效区分开来，对新冠疫情的防控具有重大的临床意义。7月3日，海尔施基因科技的T400Sanger测序仪在枫林中心发布。这也是首台国产Sanger测序仪，填补了国内基因科技领域空白。
此次海尔施发布的T400 Sanger测序仪，小巧、便捷且精准，同时具备Sanger测序和片段分析两大功能，可在一次运行中进行多个项目的检测，使用灵活方便，检测结果精准。与样本前处理系统、核酸扩增系统、核酸检测试剂盒系列产品相结合，可以为多重呼吸道病原体核酸检测提供完整的解决方案。
记者了解到，该设备已经获得了国家药品监督管理局医疗器械注册证与防控新型冠状病毒感染肺炎应急审批，是国家发改委等部门发布的《公共卫生防控救治能力建设方案》中“多重呼吸道病原体快速核酸检测系统”的关键设备。
https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/sequencing/sanger-sequencing/applications.html
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