DNA复制的酶学和拓扑学变化

一、DNA聚合酶

DNA聚合酶，其全称是依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA-polymerase，DNA-pol）。原核生物的DNA聚合酶有三种DNA-polⅠ、DNA-pol II和DNA-pol III。

DNA-pol有三种功能：

1.聚合作用

即在模板指导下，以dNTP为原料，在DNA或引物RNA的3＇-OH末端逐个加上脱氧单核苷酸，形成3＇，5＇磷酸二酯键，使DNA链沿5＇→3＇方向延伸。

2.3＇→5＇外切酶活性

即能从DNA 链3＇端开始沿3＇→5＇方向进行水解反应，产生5＇单核苷酸。在DNA复制时，当3＇末端出现错配的碱基时，可由DNA-polⅠ识别和切除错配的碱基，保证DNA复制的正确性，因而具有校对功能。

3.5＇→3＇外切酶活性

即能从DNA 链5＇端开始沿5＇→3＇方向水解DNA链。因此，参与RNA引物的切除。另外，它还能跳过几个核苷酸，切除错配的核苷酸，起到修复作用，因而，可能在DNA的损伤修复中起作用。  DNA-polⅠ催化的聚合反应可以连续进行，但DNA链延长20个核苷酸后，酶就脱离了模板，另外，该聚合反应的速度慢，每秒钟约加入10个核苷酸，说明它不是真正在复制延长过程中起作用的酶。实际上，DNA-polⅠ在大肠杆菌中的主要功能不是催化DNA的复制，而是切除引物，填补冈崎片段间的空隙，以及修复DNA损伤。

DNA-polⅡ具有5＇→3＇DNA聚合酶活性及3＇→5＇外切酶活性，但它只是在无DNA-polⅠ及DNA-polⅢ的情况下才起作用。它在生物体内的功能尚不清楚，可能是在DNA损伤修复中起作用。   

DNA-pol Ⅲ由10种亚基组成，分别为αεθτδδ′βκ及ψ，其中α亚基具有催化合成DNA的功能，ε亚基有3＇→5＇外切酶活性，θ则为装配所必需。它们三者组成核心酶，β亚基起着夹住模板链又能使酶沿着模板链滑动的作用，其余亚基统称为γ复合物。DNA-pol Ⅲ催化的聚合反应具有高度连续性，可以沿模板链连续地移动，一般在加入5000个以上的核苷酸之后才脱离模板，因此，其催化的聚合反应速度快，是在原核生物细胞内真正起复制作用的酶。其3＇→5＇外切酶活性可停止进入或除去错误的核苷酸，然后连续加入正确的核苷酸，因而具有编辑和校对功能，polⅢ和polⅠ协同作用可使复制的错误率大大降低，从10-4降到10-6或更少。

真核生物的DNA聚合酶有αβγδ及ε五种。DNA-polδ延长领头链；DNA-polα起到填补空隙以及延长随从链的作用；DNA-polε在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用；DNA-polβ起着DNA修复的作用，但它只是在没有其它DNA-pol时才发挥作用；DNA-polγ催化线粒体DNA的合成。

二、复制的保真性

复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。

1.核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正

核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。

2.复制的保真性依赖正确的碱基选择

DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。

嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。  

DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：

遵守严格的碱基配对规律；

聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；

复制出错时DNA-pol的及时校读功能。

三、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

1.DNA解螺旋酶

其作用是从复制起始点开始解开DNA双链，每解开1对碱基，需消耗2个分子ATP。在DNA复制时，大肠肝菌复制蛋白（Rep）蛋白与某种解链蛋白分别在两条DNA母链上协同作用，DnaA识别复制起始点DnaC辅助解旋酶作用使DNA双链得以解开。

2.DNA拓扑异构酶 

DNA具有拓扑性质。所谓拓扑性质是指物体或图象作弹性移动而又保持物体不变的性质。碱基顺序相同但连环数/拓扑环绕数不同的两个双链DNA分子称为拓扑异构体。能催化DNA拓扑异构体互变的一类酶称为拓扑异构酶。4.单链DNA结合蛋白（SSB）能与已被解链酶解开的DNA单链紧密结合，维持单链状态，以利于其发挥模板作用。SSB在复制过程中，可以循环利用。

3.引物酶（primase）

DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合，只能在引物3＇-OH连接下一个核苷酸。因此，当DNA复制开始时，首先需要由引物酶催化合成一短链RNA作为合成DNA的引物（primer），引物酶在复制起始部位催化合成与DNA模板互补的RNA片段。合成方向从5＇→3＇方向。不同生物RNA引物的长短不同，原核生物约有55-100个核苷酸，动物细胞约有10个核苷酸。

4.DNA连接酶（DNA ligase）

能催化双股DNA中一股缺口的3＇-OH与5＇磷酸形成磷酸二酯键，使缺口两侧的DNA片段得以连接，反应中需消耗ATP。DNA修复过程留下的缺口，均由连接酶连接封闭。