实验二  细胞骨架的光学显微镜观察

一、实验目的 

掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的结构，学会制作永久封片。

二、实验原理    

当用适当浓度的TritonX—100处理细胞时，因其非离子型表面活性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋白，就不会被TritonX—100破坏而保留在细胞中。当用考马斯亮蓝R250染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有关的蛋白质。 

考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细而在光学显微镜下无法分辨，因此看的是由微丝组成的纤维束，直径约在40nm左右。    

三、实验材料

  新鲜洋葱鳞状叶。

四、实验器材

普通光学显微镜，50ml烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子，染色板，吸水纸，擦镜纸。   

五、实验药品    

    1．M—缓冲液：所含各成分终浓度为50mmol/L眯唑，50mmol/LKCL，0.5mmol/LMgCl₂，lmmol/LEGTA(乙二醇双(α—氨基乙基》醚四乙酸)，0.1mmol/L EDTA，lmmol/L巯基乙醇或二硫苏糖醇<DTT)。1mol/L HCl调pH到6.8.

2.  0.01mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)：用0.2mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液稀释配制其中磷酸盐缓冲液配法：0.2mol/L Na₂HPO₄ 49ml、                        0.2mol/L NaH₂PO₄51ml。

3. 1％TrltonX—100，用M-缓冲液配制。

4．0.2％考马斯亮蓝R250。配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸:水(46.5：7：46.5)。

5. 3％戊二醛溶液，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制

6. 50％，70％，95％乙醇。

7. 叔丁醇

8. 正丁醇

9. 二甲苯。

10.中性树胶。

六、实验步骤

1. 撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小，取若干片，置于装有pH6.8磷酸盐缓冲液的50ml烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。

2．吸去磷酸盐缓冲液，用l％TritonX—100处理20—30min。

3. 吸去TrironX—i00液，用M-缓冲液洗3次，每次10min左右。

4. 用3％戊二醛固定0.5h。

5. 再用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。

6. 0.2％考马斯亮蓝R250染色20-30min（在染色板上）。

7. 用蒸馏水洗1—2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。

8. 如观察结果较佳，可制作永久封片：在有样品的50ml烧杯中，依次用如下试剂处理:50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇，(1/2)V 95％乙醇+(1/2)V叔丁醇，叔丁醇(以上每个步骤反应5-10min)或正丁醇，正丁醇，二甲苯，二甲苯(每个步骤5-10min)。然后，将样品置于载玻片上展开，镜检后滴一滴中性树脂，盖上盖玻片。（选做）

植物细胞骨架的形态特征

细胞骨架观察结果：

光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见（如图），细胞壁及其分界明显。10×10倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀，细胞核区域的纤维相对密集，蓝色浓重，甚至分辨不出网络结构，另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布；相邻细胞的密集程度基本一致，但有少数细胞有较大不同。

植物细胞骨架微丝结构图

10×40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成，纤维间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架较稀疏，但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓，与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。