一、开展血液代用品研究的重大意义

1.人血液代用品能满足输血需求剧增，弥补血源严重短缺

目前临床用血量迅速增加，而血源却日益减少，因此，加紧血液代用品的研究开发，已成为解决输血安全和血源短缺的战略任务。目前开发的人血液代用品基本上采用改造的牛血红蛋白，牛血的易获得性保证了大规模产业中原料的充足供应。

2.人血液代用品能解决适配血型麻烦，避免输血反应的发生

与传统的输血相比，人血液代用品具有广泛的兼容性，可以适用于任何血型，因而不需要适配过程，临床应用快捷，大大节省了紧急救治的时间。

3.人血液代用品能防止血液污染，保证输血的安全性

v病原体污染血源一直是困扰输血工作的一大难题，严重威胁输血的安全，其中病毒污染更突出。人血液代用品是经分离纯化的高纯度单一物质，不受病原体污染，是一种不携带疾病的物质，能很好地避免因输血而造成的感染。

4.人血液代用品解决了存储运输不便的问题

v血液保存期短，血液的采集、储存、运输和使用、均不够简捷。而人血液代用品易储存，常温下可存放1年多，且可制成干粉状，储存过程不需要冷藏，运输不需要专门的设备。

5.人血液代用品有着巨大的市场并能产生巨大的效益

v输血是临床不可代替的治疗手段，血液制品临床用途广泛、用量巨大。而临床用血短缺是世界性问题，寻求安全、有效、可大量生产的血液代用品已成为国际生物技术领域的研究热点，是21世纪重大研究开发项目。

v血液代用品一旦开发成功，将产生难以估量的效益，因此有着广阔的市场前景。

二、血液代用品的类型

1.无载氧功能的血管扩容剂（第一代红细胞代用）；

2.全氟碳化合物、化学修饰血红蛋白及基因重组血红蛋白（第二代血红蛋白代用品）；

3.模拟天然红细胞膜和红细胞内的生理环境，用仿生高分子材料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”。（第三代血液代用品）

全氟碳化合物

全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)国外很早就有人开始血液代用品的研究。1966年，由美国Cincinnati大学的Clark首创并做动物实验，发现小鼠在含有PFC的饱和氧中能正常生存。1978年Naito等首次将第一代氟碳化合物（Fluosol DA)用于临床实验。PFC的优点是可以直接用化学方法合成，价格低廉，而且不受生物来源的影响，避免因异体输血而造成的交叉感染。

PFC是将碳氧化合物中的氢原子全部用氟原子取代而产生的一类环状或直链状结构的有机化合物。PFC随温度变化而可成固、液、气态，常温下PFC为液态，但不溶于水，需要经过乳化变为可溶性乳剂。PFC氧离曲线与氧分压呈直线相关，不受pH值影响，其溶解氧的能力约为血液的2倍、水的20倍。

        优点：生产不依赖于过期的人血或者其他生物来源的血液，能够大批量生产，而且纯度可以很好的控制；对于不愿意接受别人血液或者血液替代品的宗教信仰者。可使用这种化学合成物；

        缺点：使用时必须呼吸70%-100%的氧；有效时间短；存放需要合适的温度和条件；流感样症状。

血红蛋白类血液代用品

1.天然血红蛋白；

2.血红蛋白类血液代用品；

    1）血红蛋白的制备；

    2）血红蛋白的化学修饰。

         天然血红蛋白

n 比全氟碳化合物更符合人体生理需要，来源广泛；

n 20世纪30年代，Amberson将制备的血红蛋白输送给动

  物进行研究，结果表明这种血红蛋白能有效地输送氧气，但是对肾脏的毒性大。其原因主要是溶血质中存在少量膜基质及杂蛋白；

n 无基质血红蛋白（stroma free hemoglobin, SFH)。

 1）失去DPG的变构调解作用（放氧和载氧降低）；

 2）易解聚为αβ二聚体，氧传递能力下降，容易从肾脏滤出，形成血尿，其代谢产物还会在肾脏小管腔内产生毒性效应。

 3）在体内保留时间短。

血红蛋白类血液代用品

n血红蛋白的制备

蛋白质提取和分离步骤

样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

操作过程

1.样品处理：

可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白

(1)红细胞的洗涤:

①洗涤目的:

去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。

②洗涤操作：

1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。

     加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液：

①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。

②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。

③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

(4)透析：

①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

②原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。

（2）凝胶色谱柱的装填

     ①凝胶的选择：

A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。

B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。

     ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

    ③凝胶色谱柱的装填方法：

A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。

B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

（3）样品加入与洗脱

①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

   ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

   ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

   ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

  ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

  ⑥注意：正确的加样操作：

1、不要触及并破坏凝胶面。

2、贴壁加样。

3、使吸管管口沿管壁环绕移动。

血红蛋白类血液代用品

n血红蛋白的化学修饰

n目的：稳定血红蛋白4聚体结构，增加蛋白相对分子量，以达到降低毒性的作用。

n原理：表面有许多可修饰的功能基团。

n类型：分子内交联血红蛋白、多聚血红蛋白、共轭血红蛋白、脂质体包封血红蛋白；基因重组血红蛋白。

分子内交联血红蛋白

n血红蛋白肽链间的交联，降低氧的亲和力。

n试剂：含有负电基团并能结合在血红蛋白中心 腔位置，如双阿司匹林类化合物（3， 5-二溴水杨基双延胡索酸酯），吡哆醛类化合物。

n产品：美国Baxter公司的DCLHb、加拿大 Hemosol公司的Hemolink

DCLHb

ndiaspirin cross-linked hemoglobin。用3，5-二溴水杨基双延胡索酸酯对脱氧的无基质血红蛋白  进行分子内修饰生成α链间交联产物。相对分子量65000。。

n 临床：患者出现皮肤黄染、无症状血尿、肠梗 阻发生率显著提高，三期临床死亡率增加，于  1999年终止临床试验。

 Hemolink

nO-棉籽糖交联血红蛋白，由各种相对分子量的 聚合、非聚合成分组成，含交联Hb大于95%。

n 临床：三期已在美国、英国和加拿大开展。不良反应是血压升高，但在48-72小时内恢复对肝肾功 能无影响。

多聚血红蛋白

n分子间修饰主要是形成分子聚合物，从而防止血红蛋白四聚体的快速解离，延长在血管中的 停留时间。

n交联剂主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。与血红蛋白反应时无特异 的结合位点，属于多位点修饰，形成相对分子量不等的交联聚合体，从而减少溶液中分子数目，溶液渗透压和黏度也随之降低。

n产品：美国Biopure公司的Hemopure和  Northfield Laboratories公司生产的Polyheme

共轭血红蛋白

n血红蛋白与天然或者合成的可溶性高分子反应，形成共轭结合物，可以大大增加Hb的稳定性，有效地防止四聚体解离；同时包裹在Hb周围的高分子链覆盖了抗原位点，起到了降低免疫原性，提高存留时间；而且，分子稳定性好，能在循环中维持较高氧含量，并降低网状内皮系统的吞噬，较少可能的过敏和免疫反应。

n可使失血30-50%的狗在两周内无死亡现象，体重、食物摄入量均正常，无明显毒性反应，尿液分析和血液动力学指标也无明显变化。

脂质体包封血红蛋白

n模拟天然红细胞膜和红细胞内的生理环境，用仿生高分子材料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”

n优点：

1）血红蛋白不直接暴露于内环境；

2）可将红细胞所属的各种酶类包括在人工细胞内，避免四聚体的解离而产生的肾毒性；

3）脂质体不与血型抗体反应，延长其循环时间；

4）血红蛋白未经过化学修饰，保证其正常生理功能；

5）包裹天然红细胞内的高铁血红蛋白还原系统；

6）包封入DPG，可降低Hb氧结合力，增加传递氧的能力。

n制备的两个基本条件：

  1）制备过程中确保极易被氧化的血红蛋白不被氧化；

  2）脂质体包封血红蛋白及其辅助成分在制备和保存过程中有足够的稳定性，并使脂质体包封血红蛋白的循环存留时间延长。

n工艺发展

        脂质体包封血红蛋白工艺的发展
n第一代脂质体：从鸡蛋、大豆中提取的不饱和脂肪酸、胆固醇以及维生素E等造成：

1）、半衰期短；

2）、不饱和脂质在血浆中的氧化使血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白。

n第二代脂质体：长链饱和磷脂，延长半衰期，降低了脂质过氧化。（合成的二硬脂酰卵磷脂）

n第三代：第二代脂质体和冻干保存血红蛋白方法的结合。（冻干的粉末状脂质体包封的血红蛋白）     日本研制的NRC（Terumo公司-泰尔茂)

脂质体包封血红蛋白缺点

主要不良反应是被网状内皮细胞吞噬，抑制网状内皮系统功能，使机体免疫功能受损，易引起感染性休克等

         基因重组血红蛋白（rHb)

n通过酵母、昆虫、转基因动物、植物进行重组血红蛋白的表达。

n具有人为控制血红蛋白产量及从根本上消除病毒污染的有点。

n基因策略：1）使红细胞蛋白亚基间串联；2）利用氢键、疏水作用力等稳定四聚体；3）将特定氨基酸突变为半胱氨酸使形成链间二硫键。

n存在问题：表达量低。

n关键环节：构建表达的rHb工程菌；提高分离纯化技术。

血红蛋白的制备

n交联剂：辛二酸二琥珀酸亚胺酯（DSS)。

n交联类型：分子内交联。

n交联过程：

n步骤：

1）高纯度血红蛋白的制备；

2）取浓缩的血红蛋白溶液，用50mM的PBS(pH7)稀释，置于容器中，然后加入溶有40mM DSS的DMSO溶液，DSS与血红蛋白的质量比：10：1，在N2保护下反应1h;

3)反应后用超滤膜浓缩并更换生理缓液，操作温度为4℃。