Ø目前绝大多数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。

Ø因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的，但人—人杂交瘤技术目前未突破，即使研制成功，也还存在人—人杂交瘤体外传代不稳定，抗体亲和力低及产量不高等问题。较好的解决办法是研制基因工程抗体，以代替鼠源单克隆抗体。

Ø基因工程抗体兴起于20世纪80年代早期。这一技术是将对抗体基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对抗体分子进行切割、拼接或修饰，甚至人工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称第三代抗体。

Ø本章将分四个部分：鼠单克隆抗体的人源化、小分子抗体、特殊类型的基因工程抗体、人源性抗体，对基因工程抗体的原理、制备及近年的进展加以详细介绍。 

鼠单克隆抗体的人源化（Humanizationof Mouse McAb）

Ø鼠单克隆抗体的人源化，就是为克服鼠源McAb的免疫原性而将其进行改造，使之和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导人抗鼠免疫反应。

Ø因而抗体的人源化有两个基本的原则：保持或提高抗体的亲和力和特异性；大大降低或消除抗体的免疫原性。

Ø第一代人源化抗体是将鼠McAb的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体（Billeta  1993）。其独特的抗原亲和力保持得很好，但因为有鼠单抗可变区的存在，仍有强烈的HAMA反应。（人抗鼠抗体反应）

进一步将鼠McAb可变区中相对保守的FR换成人的FR框架区（frame-work region），仅仅保留抗原结合部位CDR（即CDR移植互补决定区），这才是真正意义上的抗体人源化，该种抗体又称为CDR移植抗体或改型抗体。 

（1）人-鼠嵌合抗体（Human-mouse Chimeric Ab）

Ø由于人抗鼠免疫反应（HAMA）90%是针对C区的，因此设计用人C区替代鼠C（constant）区，则可能使鼠源性单克隆抗体的免疫原性明显减弱。

Ø嵌合抗体的基本原理就是从分泌某种鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠IgV区基因，经基因重组与人IgC区基因按一定方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人嵌合的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达来制备特异性嵌合抗体。

Ø通过构建嵌合抗体，用人C区取代鼠C区，可以较好解决鼠源性单克隆抗体诱发HAMA等不良反应，延长单克隆抗体的半衰期，改善单克隆抗体的药物动力学。嵌合抗体已经用于抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫等疾病的治疗，并已显示出良好的治疗效果。嵌合抗体诱发HAMA率仍较高，在导向诊断、导向治疗等方面的应用将会受到限制。

u嵌合抗体已经用于治疗黑色素转移瘤，该抗体含有人IgG1К链C区与鼠V区14.18，可特异识别神经母细胞瘤及黑色素瘤表面的GD2糖脂。大部分患者症状得到完全或部分缓解，也出现了一些副作用，如关节痛、瘙痒、短时瞳孔反应消失等。一些嵌合抗体分别用于胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、急性白血病等的治疗，证明嵌合抗体有较好的抗肿瘤活性。  

（2）改型抗体（Humanization Antibody人源化Ab）

Ø又称人源化抗体，尽管绝大多数HAMA反应是针对C区的，但有些单克隆抗体如OKT3用于人体时，其HAMA反应则主要是针对V区的，如果再把嵌合抗体的鼠FR区替换成人FR区，则可能减少单克隆抗体的免疫原性。研究指出，抗体与抗原结合的特异性和亲和力主要取决于其V区的6个互补CDR区（互补Ag决定区）。

n如果把人单克隆抗体的CDR区置换成鼠单克隆抗体CDR区，这样的重组抗体的人源化可达97%，在保留鼠源单克隆抗体特异性与亲和力的同时，又可大大降低单克隆抗体的免疫原性，发挥更佳疗效。

n但是，由于人源化抗体的构建需要替换CDR区，而且还得预先得到抗体基因序列，技术相当复杂。

抗肿瘤治疗:

※人源化抗CDw52抗体用于治疗两例非何杰金氏淋巴瘤，43d后仍未发生HAHA反应，血液及骨髓中的淋巴瘤细胞全部消失，脾肿大消退，且不抑制骨髓的正常增殖，在治疗白血病的临床试验中表明，抗体无明显的毒性及抗原性。

抗类风湿性关节炎（RA）:

※人源化抗体可用于RA的临床治疗，但具有轻度到中度的毒性，且只能短暂改善RA症状，说明尚需进一步的改进。

抗移植反应:

人源化抗体，包括IL-2R，抗CD3等抗体已经用于抗移植反应这方面的治疗。抗IL-2R人源化抗体抗-Tac-H 用于食蟹猴异体心脏移植，表明抗-Tac-H是一种较理想的抗排斥反应物，CD3抗体也同样具有抗移植反应的作用

抗病毒:

※人源化抗HSV gB及gD糖蛋白抗体具有很强的亲和力，中和HSV以及细胞保护力等明显高于其亲本单克隆抗体，如人源化的抗RSV抗体RSHZ19。保护性明显优于人免疫血清球蛋白。

抗TNF:

v肿瘤坏死因子-α（TNF）是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子。八十年代在欧美曾展开临床研究，然而由于毒副作用严重而被迫终止。

v但由于TNF-α明确的抗肿瘤活性，使得学者们不愿轻易放弃。一些临床试验用TNF-α进行隔离肢体或器官灌流，取得了轰动的成果。同时通过对TNF-α的深入研究，研制出一些高效，低毒的TNF-α变构体。因此九十年代末在欧美重新确认了TNF-α抗肿瘤的重要地位

2、小分子抗体（Small Molecular Ab）

Ø完整的抗体分子，相对分子质量较大，难以穿过血管壁，影响了靶部位对其的摄取。特别是肿瘤细胞，血供本来就不丰富，对抗体的摄取量就更少了。

Ø因此对抗体分子进行改造，使之成为小分子抗体。

Ø小分子抗体可分为Fab抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等四种。  

（1）Fab抗体

l抗体的Fab段由重链V区（VH）及CH1功能区与轻链间以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。

lFab抗体是对Fab段进行改造而获得的基因工程抗体。即将抗体分子的重链VH区和CH1功能区的cDNA与轻链完整的cDNA连接在一起，克隆到适当的表达载体后，在大肠杆菌等宿主中表达出有特异性抗原结合能力的Fab抗体。Fab抗体大小只有完整IgG的1/3。下面介绍几个已应用于临床试验的治疗性Fab抗体。

抗地高辛Fab抗体 :

   具有明显的抗地高辛中毒作用，可用于洋地黄中毒患者，可恢复房室传导阻滞。

抗去郁敏Fab抗体:

   在去郁敏（desipramine，DMI）心肌中毒的小鼠模型中应用羊抗去郁敏Fab后，可明显改善QRS间隙时间及心率，而且大剂量的效果更佳。

抗血小板GPIIbII/IIIa受体Fab抗体：

   用不同剂量的抗血小板GPIIbIIIa受体Fab m7E3抗体治疗稳定型心绞痛患者，发现Fab抗体以依赖性方式抑制血小板凝聚。

抗HSV Fab抗体：  

        抗HSV Fab19可特异识别多株不同的HSV-1及HSV-2.有100%的中和作用。

（2）单链抗体（Singlechain Ab）

Ø在重链V区cDNA3’端（VH端）与轻链V区cDNA5’端（VL端）之间，用一寡聚核苷酸接头（linker，14-25个aa为宜）连接成单链可变区基因片段，表达出一具有抗原结合能力的单链抗体多肽，其大小只为完整抗体的1/6。应用现状简介如下：

放射免疫疗法  

   放射性免疫疗法的原理与体内成像相似，必须有足够量的放射性标记ScFv（单链可变区片段）定位于靶部位，达到发挥放射性治疗的水平。ScFv的快速清除使非结合的放射性标记ScFv迅速排出，这也是ScFv有别与Fab片段的重要优点之一。       

免疫毒素治疗

单链可变区片段免疫毒素的细胞毒作用有时比化学合成的免疫毒素高15~100倍以上，其他效应功能区可与单链可变区片段-毒素融合，加强靶细胞的杀伤作用。

体内药物解毒作用   

  由于单链可变区片段的清除率比Fab快，因此单链可变区片段可能具有更强的解毒作用，如26-10ScFv可用于治疗地高辛中毒。

  单链可变区片段作为小分子抗体，保留了亲本单克隆抗体结合抗原的特异性，又使其抗原性大大降低，其药物动力学优于Fab抗体或IgG等完整抗体。单链可变区片段相对分子质量很小，能有效进入完整抗体无法到达的靶部位，如病毒的“峡谷”部位及肿瘤内部单链可变区片段。 

（3）单域抗体（Single domain Ab）

Ø抗体结合抗原主要由V区决定，只含有V区基因片段表达的小分子抗体，即只有VH 或VL 一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子就称为单域抗体（single domain antibody），其相对分子质量仅为完整抗体分子的1/12，故也称之为小抗体。         

单域抗体仅有一个结构域，制备相当简单，表达出有活性的抗体片段，因此也不失为一种有良好应用前景的基因工程抗体

★与Fab、ScFv相比，单域抗体的相对分子质量更小，更容易穿过靶组织，可以阻断病毒表面的“峡谷”部位，加强对实体瘤的渗透，得到分辨率更高的成像图谱。但由于VH单域抗体不含有VL片段，VH的疏水面暴露较大面积，致使其抗原亲和力大幅度下降，非特异性吸附有所增加，因此将单域抗体作为一种治疗性抗体应用还有许多问题要解决。 

（4）超变区多肽（hypervariable regionpolypeptide）

Ø抗体结合抗原都要通过CDR来实现，因此CDR是抗体结合抗原的最小结构单位。

Ø经晶体结构等分析，发现抗体分子中6个CDR所起的作用是不同的。可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，就称之为超变区多肽（hypervariable region peptide）。

Ø超变区多肽的氨基酸序列与CDR区完全一致，大小只有16-30个氨基酸，相对分子质量很小，对组织细胞具有极强的穿透性，能达到其他抗体不能到达的部位。所制备的87、92、6McAbVH功能区的CDR2多肽，其特异性与亲代抗体相似，能与某些细胞表面的呼肠孤病毒III型受体有效结合，使该受体表达下降，并抑制细胞内DNA的合成。

  超变区多肽可用同位素、荧光素标记或与毒素、药物等结合，用于疾病的诊断及治疗，已经用于临床检测肿瘤。

  应该看到，由于只含有一个CDR区，它的结合抗原能力是不完全及不稳定的，其亲和力及非特异性吸附都可能明显增加，相对分子质量极小，在体内相当不稳定，可能还没有完全发挥其生物学效应时已被清除。 

3. 特殊类型的基因工程抗体

根据构建方式的不同主要分为三种：

    ①双特异性抗体；

    ②免疫黏连素；

    ③催化抗体。 

（1）双特异性抗体（Bispecific Ab，BsAb）

天然的抗体分子为双价单特异性，如果对天然的抗体分子进行改造，把其他的效应物质如毒素、酶、细胞因子、受体分子通过一定方法与两种杂交抗体Fab片段或V区（VH与VL）连接起来，使之即可与靶细胞结合，又可介导其他一些效应功能，从而最大限度地杀伤靶细胞。这种具有双特异性的抗体分子就称为双特异性抗体或双功能抗体。

☆抗肿瘤

①介导活化的T淋巴细胞。

②介导巨噬细胞的肿瘤免疫疗法。

③除了介导肿瘤细胞与效应细胞的结合外，BsAb还可用于向肿瘤细胞输送免疫毒素。

④BsAb还用于介导其他药物的肿瘤杀伤作用。

☆抗血栓形成

   通过化学交联物制备完整抗纤维蛋白单克隆抗体与抗组织纤维蛋白酶原激活物抗体（抗tPA）BsAb。在体内、外均能有效地介导纤维蛋白酶原激活物与纤维血栓的结合，通过特异聚集tPA于血凝块处，在明显减少tPA量的情况下诱发了其强有力的治疗效应，可以对抗血栓形成，同时也避免纤维蛋白原的溶解及出血的副作用。

☆抗感染作用

   BsAb一样适用于介导病原体的代谢。

BsAb构建法：

①化学交联法：SPDP（琥珀酰胺吡啶二硫酚丙酸）随机交联2个Ig分子表面上的巯基构建出双功能Ab。

②生物学法（杂种—杂交瘤法）：

③gene工程法：构建出的小分子双特异性Ab（SCFV）（双功能Ab）将不同Ab的VH和VL区的gene用接头（Linker）连接，生成原Ab的分子内配对（不能形成链内的分子配对）BsAb（SCFV）2。

（2）免疫粘连素（Immunoadhesin）

   人细胞受体或粘附分子等基因通过一定的方式与抗体的恒定区gene（主要是Fc段）的N端连接起来，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体样蛋白质分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其他效应功能。与双特异性抗体不同的是，免疫粘连素由于不含有抗体的Fab段，但可发挥抗体的特异性效应功能，还含有细胞受体的结合位点，可特异性与受体阳性细胞高亲和结合，发挥新的效应功能。 

优点：

①亲和力强；

②半衰期长；

③大大隆低了其工作浓度；

④减少非特异副作用及HAMA发生率，应用上比亲本单克隆抗体更为安全可靠。

（3）催化抗体

（Catalytic Ab or Ab Enzyme）

Ø抗体能与抗原特异结合，酶也能与其底物特异结合，但这两种结合过程本质不同。天然的抗体不具有酶结合活性，而酶则无抗原结合能力。如果能人工设计一类新型蛋白质，使之同时具有抗原结合的专一性及催化底物的特异性，这种高效的抗体催化剂将可能应用于化学、生物学、临床医学等领域，为生物催化提供新的理论基础. 

Ø根据免疫学及生物化学的基本原理，利用基因工程技术，目前已经成功制备了这类催化抗体或抗体酶。抗体酶的高效催化特性及位点特异性蛋白裂解酶活性为临床疾病治疗提供了新的途径，并非常有可能成为肿瘤导向治疗的新方法。

Ø基因工程催化抗体的构建是通过在轻链V区中插入能与金属离子结合的氨基酸序列，再与重链V区重组，这种重组抗体的重链V区可识别抗原并选择性结合底物，轻链则可通过促进底物反应过渡态的形成而发挥催化作用。

4.人源性抗体

Ø由于鼠源性抗体治疗应用中存在着程度不一的人抗鼠的Ab的HAMA反应，由于人-人杂交瘤的不稳定等缺点使得通过传统杂交瘤技术分离高亲和力的稳定人抗体克隆变得十分困难。

Ø近年来，创建了噬菌体抗体库技术和基因敲除、置换技术，并利用这两种技术成功地制备了完全人源化的抗体片段及全抗。 

1）噬菌体抗体库（phage Ab Library）

     利用基因工程的方法可将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体，这种技术称为噬菌体抗体库（phage antibody library），所构建的抗体库称为全套抗体库（repertoire antibody）或组合抗体库（combinatorial antibody library）。 

基本原理

  该技术以噬菌体为载体，将抗体基因（Fab或ScFv基因等）与噬菌体编码的外壳蛋白Ⅲ（CPⅢ）或Ⅷ（CPⅧ）相连，在噬菌体表面以抗体-外壳蛋白融合蛋白的形式表达。经辅助病毒感染后，借助CPⅢ的信号肽穿膜作用，进入宿主细胞的外周基质，在正确折叠后被包装于噬菌体尾部，随后携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段噬菌体颗粒。可以特异识别抗原，又能感染宿主进行再扩增，因此可以采用类似于亲和层折原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。 

   1990年Mullinax等首次从受破伤风毒素免疫的供者外周血B细胞中组建了人抗体库，容量达107，筛选出10株抗破伤风类毒素单抗。这是首例用抗体库技术获得的全人源化抗体，开创了单抗制备的新纪元。 

噬菌体抗体库技术与传统的杂交瘤技术相比具有

明显的优越性：

①简便易行，节省时间；

②筛选的容量大，用杂交瘤技术只能在数月内筛选数千个克隆，而噬菌体抗体库技术则可以数周内筛选出106-108个克隆；

③抗体库技术直接得到抗体基因，避免了杂交瘤细胞克隆不稳定的缺点；

④抗体库抗体可用原核细胞表达，无需组织培养，可大大降低单克隆抗体生产的成本。噬菌体抗体库技术在不久在将来将有可能取代杂交瘤技术。

（2）Xenomouse（异源性或异基因鼠）产生的人源性抗体

        噬菌体抗体库制备的抗体通常为Fab片段或ScFv抗体，由于没有Fc段，亲和力受到极大影响，人们试图通过基因工程的手段来制备人源性抗体全抗。

1997年Abgenix公司在这方面取得了重大突破，研制成功了Xenomouse，利用这种小鼠可制备高亲和力的人源性抗体全抗。原理就是：将小鼠的全套抗体基因去除，同时将人的大部分轻链、重链基因插入到小鼠的染色体当中，这样用抗原刺激小鼠时就可以发生人抗体基因的重排，从而产生人源性抗体。