一、乙型肝炎治疗性疫苗的研究进展

v20世纪80年代初国外已有报道用乙肝预防性疫苗治疗HBsAg阳性儿童，无症状携带者及慢性肝炎患者的临床研究，均被证明无效。

v从90年代初，法国学者又开始了用预防性疫苗治疗乙肝患者的研究。1994年Pol等用重组GenHavacB疫苗（CHO细胞表达）的HBsAg+PreS2，20μg/次，每月一次，共三次，治疗慢性乙肝患者，以后进一步用疫苗治疗加用干扰素，结果32名患者31%血清HBVDNA转阴，4名降低（13%）。 

v中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多、也最成功的一类细胞。

v此后，巴斯德研究所开展了多中心双盲对照的大规模临床研究；Coullin等于1999年已报道在治疗者中，27名患者中的7名出现了对HBsAg的特异性淋巴细胞增殖反应及释放更高的Th1类的细胞因子。

v我国在这一研究中缺少双盲对照，及所用检测试剂的标准化与可比性间尚有不足之处。

v盲法试验主要包括单盲试验（single-blinded）、双盲(double blinded)试验等。

v单盲试验是仅研究者知道每个病人用药的具体内容，而病人不知道，单盲试验虽可以避免来自病人主观因素的偏倚，但仍未能防止来自研究者方面的影响。双盲试验是研究者和病人都不知道每个病人分在哪一组，也不知道何组接受了试验治疗，此法的优点是可以避免来自受试者与研究者的偏倚。

vChisari等以HBcAg为治疗性疫苗的病毒表位也做了许多工作。他们找到了能在HLA-A2人体中诱生CTL应答的表位肽（p18-27）；

vVitello等（1995）用该肽加入破伤风类毒素肽p830-843，再加入2个分子的棕闾酸作为类脂成分，制成的治疗性疫苗（商品名为Theradigm-HBV），可100%的诱生CTL。

v在裸核酸免疫（DNA免疫）治疗性方面，用转基因鼠取得了很有希望的结果。

v法国学者（Michel，1995）首先在正常鼠中证明，以编码有HBsAg-100μg的裸DNA免疫可引起细胞及抗体免疫应答。

vShimizu等（1998）在5种不同品系的HBV转基因鼠中发现，体外用细胞因子激活树突状细胞（DC），可以有效地激活转基因鼠中的CTL，并认为处理树突状细胞较DNA免疫更强。

乙型肝炎疫苗的研究进展

v明确了乙型肝炎治疗性疫苗免疫耐受抗原为包膜抗原，以针对HBsAg为耐受原的为首选疫苗；

v候选疫苗应既可增强抗原提呈细胞的抗原功能，又需促进DC-T细胞间的相互作用；

v候选疫苗应能促进HBV特异的CD8杀伤细胞作用，但应尽量减少激活非特异CD8的作用；

v治疗过程中，除应及时了解HBV特异的CD8及所分泌细胞因子的情况，还应了解NKT及NK细胞的应答；

v至今并未发现治疗性疫苗诱发干细胞坏死等严重不良反应；

v建立检测CD8细胞及其功能以及NK细胞、T细胞功能的方法，为疫苗的研制提供有价值的科学资料。

二、免疫复合物型乙型肝炎治疗性疫苗

v我国863高技术计划支持下，早在1988年起，已开始了对治疗性乙肝疫苗的研究。

v根据我国多数乙肝患者是幼龄感染乙肝病毒，加之慢性乙肝患者血清中无有效的抗HBsAg抗体及细胞免疫应答，研究课题组提出了多数患者处于对HBsAg免疫耐受的状态，而治疗性疫苗的抗原应以HBsAg为靶抗原，通过消除机体对HBsAg的免疫耐受性，以产生有效免疫应答的治疗患者的路线。分以下阶段进行：

1.建立动物实验模型

v利用鸭乙肝动物模型，研究幼龄感染鸭是否可造成模拟人感染的对HBsAg的免疫耐受状态。

v在获得确可建立实验动物模型的基础上，确立了免疫耐受动物模型的标准，规定了观察时间，以及判断消除免疫耐受状态的指标，建立了可供研究人乙肝免疫耐受状态的动物模型并进行了消除免疫耐受性的实验研究。

2.探讨消除免疫耐受状态的治疗策略

v在主动免疫与被动免疫中进行了选择。

v主动免疫的优点为：注入有效的免疫原方法简单，安全性较高，通过调动机体本身的免疫应答，故有效持续的时间可较长。

v其缺点为：如患者的免疫应答普遍低下，则效果会较差。

v被动免疫包括输入经细胞因子激活或改造的自身免疫细胞、或输入具有对HBsAg强免疫应答的他人免疫细胞等。由于已证实被动输入抗HBsAg仅能短暂使血清中的HBsAg滴度下降，并无治疗作用，故不再考虑。

v被动免疫的操作复杂，选择对象严格，需特别防止污染，医疗环境的要求高。

v鉴于慢性乙肝感染者不同于HIV感染者或肿瘤患者，一般具有对抗原刺激的正常应答，仅为对HBsAg有免疫耐受，因此可定位于主动免疫。

v主动免疫策略为：

①改变抗原组分，使机体从免疫耐受转为识别抗原而产生免疫应答；

②调节抗原提呈的方式或途径，使机体对经调节后提呈的HBsAg产生免疫应答。

v研究表明，HBV（乙肝病毒）感染人体后，HBV即侵入肝脏，与肝细胞核染色体发生聚合产生HBV复制模板。这种病毒复制模板如同产生新病毒的源头，不断复制大量病毒，从而形成HBV感染持续状态。
HBV病毒感染一直是世界医学界的难题，现有的抗病毒药物不能直接杀灭肝细胞内的病毒，仅能抑制病毒的复制。

v“抗HBV特异性主动免疫疗法”最先诞生于美国，该疗法以激发重建患者体内抗病毒免疫功能为科研思路，打破免疫耐受，达到清除病毒的目的。

3.改变抗原组分

v在鸭乙肝病毒包膜抗原中用合成肽段及用合成肽免疫动物的方法，选择强免疫原性决定簇。发现鸭乙肝病毒PreS的第125～146氨基酸的免疫原性强，用该肽段免疫所获得的抗体可与天然鸭乙肝病毒包膜结合。

v法国和美国学者证实该肽段位于中和性抗原表位中，更明确可用此肽作为候选治疗性疫苗。

v用该肽段与破伤风类毒素交联免疫耐受鸭，可以使50%鸭的病毒DNA转阴，但多次应用后效果未见提高。此后进行了用双肽共免疫的主动免疫法。

Ø将鸭乙肝病毒包膜PreS125-146肽与破伤风类毒素中的830-843（能有效地激活T细胞的肽）共免疫耐受鸭，试图消除免疫耐受，效果比前一种组分更差。

Ø合成肽的结果说明，试图单用合成肽组分制备治疗性疫苗的途径以消除对乙肝病毒的免疫耐受性，成功的机会极少。

4.调节抗原提呈途径或方式

v对鸭乙肝病毒包膜抗原进行了三种不同的调节抗原提呈实验。

  ①首先获得了鸭乙肝病毒编码的DHBsAg+PreS克隆，再通过与痘苗病毒重组，获得在细胞中可表达鸭乙肝病毒包膜抗原的重组痘苗。在正常鸭中，接种该重组株后，鸭血清中可测及DHBsAg。证明这一重组痘苗可在鸭体内表达抗原后，用以在免疫耐受鸭中进行治疗。结果显示，结合痘苗病毒的复制与抗原调节提呈DHBsAg，并不能有效地消除免疫耐受性。

v对鸭乙肝病毒包膜抗原进行了三种不同的调节抗原提呈实验。

  ②第二种调节的途径为，通过将DHBsAg与葡萄球菌CowanI株，及抗DHBsAg组建成固相抗体抗原免疫原性复合物（SMAA），以调节DHBsAg的抗原提呈。用SMAA免疫耐受鸭后，可在约50%的耐受鸭中清除DHBsAg，在60%～70%鸭中清除病毒DNA，并在部分鸭中产生了抗DHBs。在SMAA实验中发现，单用DHBsAg+抗DHBsAg组建免疫原性复合物（IC，immunogeniccomplex），也具有可以在约50%耐受鸭中清除病毒及DHBsAg的作用。

v对鸭乙肝病毒包膜抗原进行了三种不同的调节抗原提呈实验。

 ③第三种对调节DHBsAg抗原提呈的研究是用抗原加特异的抗体可提高抗原的免疫原性，但用这种制剂消除免疫耐受的途径未见报道。经多次实验证实DHBsAg+抗DHBsAg组建成复合物，确能消除部分鸭的免疫耐受性。这一种治疗性疫苗的研制已获我国发明专利（1997年授权）。

5.研制并开发可供人体应用的治疗性疫苗

v为尽快开发，可供人体应用的治疗性疫苗，选择了乙肝疫苗及人高效价抗乙肝免疫球蛋白（HBIG）组建免疫复合物型治疗性疫苗。在抗原抗体配比，制备疫苗的工艺，产品标化，效力试验的参比实验等技术方面进行了研究，与下游单位协同合作，现已进入中试。

6.研究复合物型疫苗的作用机制

v为研究复合物型疫苗的作用机制，选用了免疫学基础研究较成熟的小鼠为研究模型。结果证明复合物型乙肝治疗性疫苗的作用机制为:

1）通过复合物中抗体的Fc段，与抗原提呈细胞表面的Fc受体结合，促进了细胞摄取抗原。当用酶消化去除抗HBs的Fc段，虽可形成抗原-抗体Fab段的复合物，但不能增强被巨噬细胞所摄取。

v当用异种动物（如羊）的抗HBs组建复合物，因与鼠的巨噬细胞的Fc受体不相应，也不能促进抗原的摄入与提呈。

2）复合物中的抗原经提呈后可比单纯抗原更有效地激活T细胞增殖，释放更多的γ-干扰素和IL-2，属TH1类应答。

v复合物在正常小鼠中诱生的抗HBS较单纯抗原诱生的抗体高10倍以上。