v当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重要细菌感染性疾病的问题有：

①现有菌苗保护效果不好；

②副反应大；

③难以培养的细菌；

④可诱发癌变，有严重后遗症；

⑤新出现的病原体或新变异病原菌。

一、霍乱菌苗 (Cholera vaccine)

霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。

v霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（CT）引起腹泻及其他症状。

v已知有O抗原，毒素共调节菌毛（TCP），血凝素（HA），外膜蛋白（OMPs）等，及引起水样腹泻的霍乱毒素（CT）由AB5的六聚体构成。

v霍乱产毒株ctxAB的5’端有一6kb的DNA，依次有20t,ace,orfu,cep和RS序列与ctxAB一起称为霍乱毒素元件（CTX），可进行转移，与一种丝状噬菌体（CTXΦ）有关，而非产毒株没有这段DNA 。

v据菌体抗原霍乱弧菌可分为200个以上的血清型

v1881-1896年间的5次及1899-1923年的第6次大流行均由O1群古典型霍乱弧菌引起。

v第7次大流行自1961年延续至今，波及五大洲

v1992年出现了一新的流行株O139血清型霍乱

v目前流行的霍乱为O1和O139两种血清型。

v近十年来研制的新霍乱菌苗有四类：

1.BS/WC灭活菌苗(BS/WC dead bacteria vaccine ）

  由提取的或重组的霍乱毒素B亚单位（BS）及杀死的全菌细胞（WC）组成。

2.CVD103-HgR减毒活菌苗（Levine  1998）

  在美国获准，为一次剂量的霍乱活菌苗。它是由霍乱经典型569B菌株构建而成的CVD103减毒株（CTA-B+）。并在其染色体溶血素基因nlyA位点插入汞抗性基因作为筛选标记。

3.以沙门氏菌为载体表达霍乱弧菌O抗原的伤寒/霍乱双价菌苗。

4.O139减毒菌苗候选株CVD112及Bengal-15

a副反应包括由疫苗株引起的腹泻，腹部痉挛，厌食，发热

b服苗者粪便中排菌苗株的百分率

c用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率

d攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型霍乱弧菌的百分率

e未得到数据

f未做 

v另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜免疫原，能有效刺激黏膜sIgA及血清IgG反应，及黏膜免疫记忆反应，对CT及CTB的免疫佐剂活性进行了大量的研究，对多种蛋白、多糖及病毒、细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认识。进展情况见下表。

CT/CT-B佐剂应用的抗原

                                                                 

抗原（佐剂）	途径	参考文献
蛋白质
破伤风类毒素（CT）	p.o	（Jackson et al,1993）
链球菌M蛋白（CT-B）	i.m	（Bessen and Tischetti,1988）
链球菌
（CT-B）
S.Mutans抗原I/II（CT/CT-B）	p.o	（Czerkinsky et al,1989;Wu and Rusell,1993）
S.Mutans蛋白质抗原（CT-B）
流感病毒溶血素（CT/CT-B）	i.m	(Takahashi et al.,1990)
呼吸道合胞病毒FG糖蛋白（CT/CT-B）	p.o,i.m	（Tomasi et al,1994）
S.mutans Gtf.1：pho A融合蛋白	i.m	（Walsh,1993）

                                                                       

多糖	p.o	(Tomasi et al,1994)
沙门氏菌多糖（CT-B）	p.o	（Orr et al.,1994）
P．aeruginosa多糖（CT）	p.o	（Abraham and Pobinson,1991）
病毒
完整流感病毒（CT）	p.o	(Chen and Strober 1990)
仙台病毒（CT）	p.o,i.m	（Nedrud et al. 1987）
Neasles病毒（CT-B）	i.n	(Muller et al,1995)
呼吸道合胞病毒（RSV）	i.n	(Reuman et al, 1991)
细菌/原生动物
幽门螺杆菌（CT）	p.o	(Czinn and Nedrud,1991)
弓形体（CT）	p.o	（Bourguin et al.,1991）
阿米巴原虫多肽-CT-B融合蛋白	p.o	(Zhang et al,1995b)

二、痢疾菌苗（Dysentery vaccine）

v痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率始终居24种法定传染病的前二位。

v主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞噬泡膜进入胞浆。

v临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后重，甚至引起神经症状和血尿综合症。

v痢疾菌共有4群：A志贺氏痢疾菌（Shigelladysenteriae），B福氏痢疾菌（S.flexneri），C鲍氏痢疾菌（S.bordii）和D宋内氏痢疾菌（S.sonnei）。

v按其菌膜表面LPS-O抗原分为44个血清型。

v目前已知至少27个基因和15个蛋白与痢疾菌入侵宿主细胞相关，它们作为III型分泌系统的调节子与效应子，以接触依赖方式被分泌进入宿主细胞。

1.死菌苗（Deadbacteria vaccine）

v五、六十年代动物及人体实验证明灭活的痢疾全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的抗体，但没有保护效果；

v用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在豚鼠和猴中证实可提供特异保护，证明LPS-O多糖是保护性抗原；

vRobbins(1992)将痢疾菌LPS与不同蛋白载体（TT，DT）交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血清抗体反应，豚鼠眼模型证明有一定保护作用。

v宋内氏LPS-O-蛋白（TT，DT）有保护作用，Robbins（1996）将多糖-蛋白结合苗用于越南士兵，报告宋氏多糖-蛋白结合苗保护效果达70%。

2.活菌苗（Living bacteria vaccine）

v采取了多种方法进行痢疾菌野生毒株的减毒研究。

vMeitert等（1984）在胆盐平皿连续传代32次获得S.f2a减毒株IstratiT32；

v80年代初中国近一万人现场观察，证实T32菌苗安全，有保护活性，效果与免疫次数和剂量有关。

v80年代中国国内以T32为受体株开始致力于构建双价痢疾菌苗株的研究。

v牟兆钦等，1989年将一编码宋内氏菌LPS-O抗原的大质粒转移至T32菌中获得福氏2a宋内氏双价痢疾菌苗株FS-18，FSM2117；宋树珍等构建了FS痢疾双价菌苗株，其中FSM2117识别福氏2a和识别宋内氏痢疾苗LPS-O抗原；

v林纪胜(1999)构建了S.flexenri 2a和S.dysenteria I双价痢疾菌株，有双价免疫原性，现FSM2117与FS两株痢疾双价菌苗均已获国家新生物制品证书和试生产文号。

v90年代国内外开展了痢疾侵袭活菌苗的研究。主要针对痢疾菌毒力相关基因的插入失活或缺失的方法，构建减毒突变株，目的是保存其入侵能力，限制其无限繁殖能力。对其免疫原性和保护效果进行了大量实验室研究。

v国外工作主要集中在福氏2a，福氏5型或Y型。构建出福氏2a-宋内氏双价侵袭的菌苗株，目的是降低目前非侵袭双价苗的免疫剂量，提高免疫原性。

v痢疾杆菌III型分泌系统将不同侵袭蛋白分泌和导入宿主细胞的调节分子与效应分子的鉴定，可能会找到构建痢疾基因工程菌苗新的靶分子和靶基因。

三、产毒性大肠杆菌（ETEC vaccine）

vETEC是婴幼儿和旅游者腹泻的主要病原菌。

v全球年病例为2.1亿次，死亡病例达38万，多为5岁以下的儿童。

v其致病特征是分泌ST和LT毒素及菌膜表面存在致病相关的菌毛抗原CFAs。正在采用减毒痢疾菌为载体进行LT或菌毛抗原的表达，进行多价菌苗研制的前期工作，或用重组的BCG为载体进行LT-B的表达研究。国内早年构建表达K88、K99及LT的幼畜工程菌苗已投入生产。

四、 肠出血性大肠杆菌苗（EHEC苗）

v大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠杆菌的主要病原菌，首次鉴定于1982年。1996年日本大规模爆发EHECO157出血性肠炎以来，引起国际上的极大关注。

v致病特点通过特殊的黏附分子（intimin）黏附靶器官，产生类志贺毒素和肠溶血素（hly）等，出血性腹泻，溶血性尿毒综合症，血栓形成性血小板减少性紫癜。

当前研制的菌苗O157多糖绿脓杆菌外毒素蛋白的结合苗（O157LPS-rEPA），已进行I期临床观察，认为安全，有免疫原性。重组的Stx的减毒活菌苗，重组Stx亚单位苗及钴照射的全菌死菌苗正在进行动物实验观察。

五、伤寒杆菌（Typhoid bacillus vaccine）

v伤寒杆菌能入侵肠黏膜上皮细胞，在吞噬细胞酸性吞噬泡内存活，经淋巴系统进入血流引起菌血症，近而侵犯肝，脾，肾等多种脏器与器官，并大量繁殖而再次引起严重菌血症，临床表现为高热，胃肠炎，败血症等。

v世界伤寒杆菌感染病例约300万，死亡人数50万。灭活死菌苗已有70余年的历史，由于副反应较大的问题促进了活苗的研制。

①Ty21a 是Germamier经NTG诱导后，筛选得到伤寒VigalE减毒株。它缺乏UDP-4-半乳糖异构酶而不能正常合成胞壁脂多糖，在体内外有半乳糖供给情况下可正常合成细胞壁。

②伤寒Vi多糖苗   Vi是位于菌膜LPS外的荚膜多糖抗原，由O-乙酰-氨基糖醛酸高度聚合而成，可阻止外膜与补体的结合，对菌的入侵也有一定作用。目前正进行Vi多糖与蛋白交联的结合苗的研制。

③另外，国内外用减毒的伤寒杆菌或鼠伤寒杆菌作为载体表达外源抗原进行多价菌苗研究的探索。

六 、结核菌苗（Tubercle vaccine）

v据WHO估计，全球每年增加结核病人达800万，年死亡病例为300万。

v全球有1/3的人（即17亿）曾感染过结核，其中90%-95%的人感染初期并无症状，此时虽然机体的免疫反应控制了初始的感染，但并未完全排除病原体。

v最近的研究进展证明T细胞不仅只分泌TH1类的细胞因子激活感染的宿主细胞杀伤病原体，而且通过CTL溶解感染靶细胞和胞内病原体，CD8+T细胞在直接杀伤胞内结核杆菌有其特殊作用。

v结核杆菌是专性需氧胞内致病菌，由于血清各种检测方法交叉反应严重，至今不甚清楚它的抗原决定簇的定位及数目，其毒力机制不清。

Ø卡介苗（BCG）是预防结核病的唯一活菌苗，经大量资料的统计指出BCG的效果波动很大（0%-80%）。以及在艾滋病人和HIV携带者接种BCG后发生全身性感染，促使人们研制新一代结核菌苗。显然核酸免疫是结核菌苗的重要研究方向。

Ø由于BCG广泛应用的安全性，它可长期在体内存活，其增殖可达几个月，生长缓慢可诱发强的，持续的免疫应答，具有佐剂活性，可诱发TH1型免疫反应，以BCG为载体构建重组疫苗的研究日益受到注意。

七、 流感嗜血杆菌苗（Hib）

v流感嗜血杆菌（Hib）为革兰阴性的有荚膜短小杆菌，其荚膜多糖有特异型免疫原性，其中b型毒力最强，主要引起化脓性感染如急性肺炎、脑膜炎、败血症等，常在流感、麻疹、百日咳、肺结核等之后合并感染。

v磷酸聚核糖基核糖醇（PRP）是Hib多糖菌苗的有效成分，将PRP与载体蛋白如白喉（DT）、破伤风类毒素（TT）、脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP）等共价交联成多糖-蛋白结合苗。证明Hib-蛋白结合苗对婴幼儿使用安全，有免疫原性，可诱导免疫记忆，入侵性Hib嗜血流感杆菌感染有防御作用。        

v由于Hib结合苗的成功，WHO对目前批准的23个血清型肺炎球菌多糖与蛋白交联的结合苗，在各地进行临床观察，其中美国已完成III期临床，认为高度有效，用结合苗控制肺炎球菌病很可能会获更大成功。

八、 细菌的DNA苗

ØDNA菌苗是用编码抗原基因的真核表达质粒DNA直接于体内接种后，被细胞摄取并转录翻译，表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。

Ø进展情况列于下表。

细菌DNA免疫研究情况

                                               

病原体	DNA编码抗原	注入途径	动物模型
Clostridium letani   （破伤风杆菌）	毒素C-片段	肌注（i.m）	小鼠，新生鼠
Borreliaburgdorferi   （伯氏疏螺旋体）	OspA	肌注（i.m）	小鼠
Mycobacterium tuberculosis   （分枝结核杆菌）	P85,p36   HSP65	肌注（i.m）	小鼠
Salmonella typhimurium   （鼠伤寒沙门氏杆菌）	OMP		小鼠
Mycoplasmapneumoniae   （肺炎支原体）	A81,   A7-1	肌注（i.m）	小鼠

v在核酸免疫研究中，用减毒的胞内细菌释放DNA苗的报导引人注意。v绝大多数的胞内菌都可被DNA转染，携带这些质粒进入细胞的吞噬泡或胞浆，释放DNA；表达编码抗原，诱导体液或细胞免疫。

与裸DNA释放相比，用细菌释放DNA的优点如下：

1）增加靶向性：

v用肌肉注射或基因枪注入DNA只能转染有限的抗原提呈细胞（APCs）；而通过适当的细菌释放DNA，能将质粒DNA特异靶向相关免疫组织的APCs，且除APCs外，还可靶向树突状细胞（DCs），能更好地进行抗原提呈。

2）增加免疫原性：

v细菌的成份，如G-菌的脂多糖和G+菌的脂肽酸及细菌DNA中没有甲基化的序列等，都有佐剂活性，可增加释放DNA的免疫原性。

3）增加免疫途径：

v细菌载体还能进行口服，转染肠相关淋巴组织，促进粘膜免疫效果。他们可停留在吞噬泡中，也可通过分泌溶质膜素破泡而进入胞浆。控制抗原提呈的途径及相应的T细胞亚类的效应反应。

v用胞内细菌释放DNA系统也存在危险因素：

1）入侵性虽然利于DNA释放，也存在毒力回复的危险。

2）G-菌的脂多糖也有毒性问题。

3）释放的DNA有整合到宿主细胞基因组的可能。