一、人血浆白蛋白制剂的制备（preparation of human blood  plasma albumin）

（1）结构和性质 （structure and character）

v人血是一种红色混浊的、具有一定腥味与粘滞性的液体。用适当的抗凝剂除去其中的有形成分（如红血球）而得到淡黄色、半透明的液体叫血浆。

Ø血浆中除含有大量的水分以外，还含有血浆蛋白等溶质。

  v白蛋白（albumin）又称清蛋白，白蛋白是血浆蛋白中含量最高（3.8～4.8%）、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。

v白蛋白对治疗因失血、创伤、烧伤等引起的休克，脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高，防止低蛋白血症，肝硬化或者由肾病引起的水肿与腹水等严重疾病具有良好疗效。

Ø白蛋白为单链分子，由584个氨基酸残基组成，N端为天门冬氨酸，C端为亮氨酸，分子量为6.6×104，在离子强度为0.15时，pI为4.7，易溶于水，在60%硫酸铵饱和度以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。

Ø从人体中分离的白蛋白有两种：一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。

血（无抗凝剂）→自然凝固→分离出血清（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）

2.生产工艺路线

工艺要点

①络合

Ø对于络合所要求的pH值，可以略高些，这样，白蛋白络合完全，络合物形成一个相当硬的块，倾倒上清液方便，损失少。但不能太高，以防络合血浆中的其它蛋白，影响解离与白蛋白制剂的纯度。

Ø若pH值偏低，络合不完全，络合物松软，甚至成汤状，不利于倾去上清液。

Ø血浆搅拌用NaHCO3调节pH至8.5-8.7之间，缓慢加入与血浆等体积的2.3%利凡诺溶液，边加边搅拌，充分络合后。

Ø静置2~4h，分离上清与络合物沉淀。

F加入2.3%利凡诺溶液比加入5%利凡诺溶液的效果好？

F因为加5%利凡诺（乳酸依沙吖啶）溶液常造成灭活时白蛋白部分变性或者分装困难。加入2.3%利凡诺溶液的体积一般不超过血浆体积的一半。这可能是加入利凡诺溶液除去了解离物中过多的Cl-而澄清，或者是加入的利凡诺（过量）使白蛋白与利凡诺的络合物反溶，从而使造成混浊的物质消失，达到澄清的目的。

②解离

Ø生产中要严格控制溶液的温度。

Ø25℃左右室温，络合物形成一个硬块，利于去上清和解离。温度太低，虽然不影响络合，但络合物呈稀糊状，倾倒上清液时常会丢失部分络合物，而且络合物内残存较多的利凡诺的水溶液。

Ø解离温度要维持在40℃左右，是解离反应的最适温度。

Ø解离液的pH值在1.28~1.45之间，解离效果良好。

络合物中加入解离液并搅拌均匀后，将解离后混合溶液pH值控制在6.0左右较理想。

p以解离后解离混合溶液pH值决定加入解离液的体积。

解离后解离混合液的pH值高于6.5时，表明加入的解离液少了，有部分络合物未被解离开；

p低于5.85，表明加入的解离液多了，解离过度。这两种情况下，解离效果均不佳。

Ø在沉淀中加约二分之一血浆体积的灭菌蒸馏水解离所得到的络合物沉淀，将解离混合物溶液用0.5mol/L HCl调节pH至5.5-6.0，加NaCl至0.15%～0.2%，充分搅拌、4℃过夜解离（8-10h）。

在生产过程中常发现，由于解离效果差，从而不能使生产过程顺利进行。方法：

（1）加入活性炭法：在解离效果略差，即能够较顺利地离心，得到部分或全部稍混浊的滤液，但不能正常进行压滤时，加入适当的活性炭于滤液中，搅拌均匀后，立即离心，由于活性炭吸附溶液中粘稠物质，形成大颗粒，经离心可以除去杂质，起到澄清的作用。

（2）加入利凡诺法：在解离时，在由加入的盐酸或（和）盐过多而造成解离物的滤液混浊的情况下，变性前后，向解离物中加入适量的利凡诺溶液均会起到澄清的作用，而回收率却不会降低太多。

变性前加利凡诺溶液比变性后加利凡诺溶液的效果显著。由于前者在变性过程中反应温度升高了，反应时间增加了。

（3）多次络合法

p如果解离效果极差，用以上两种方法处理都难以达到澄清的目的，那只有采取多次络合法，即在尽量除去解离物中粘稠物质后，将其pH值调至9.0~9.2，加入适量的5%利凡诺溶液，进行重络合，继尔重解离，一般都会得到很理想结果。如果仍然出现解离不良的现象，重复以上处理过程，直到得到满意的结果。

p这种方法使产品纯度高，外观变黄（棕），同时也使成本提高，回收率降低。

③去杂蛋白：白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白质变性的温度都会使白蛋白变性。65℃条件下变性1h，离心分离出上清液。

④热处理：在60±0.5℃条件下处理10h，灭活病毒。

⑤检验方法：冻干品白色疏松物体。白蛋白含量占95%以上，水分<1%，水溶后pH为6.6-7.2，硫酸铵残量<0.01%，细菌学和热原质检测合格。

二、尿激酶（urokinase）的制备

栓梗塞疾病。

v天然尿激酶是由两条肽链通过二硫键连接而成。是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸、组氨酸是活性中心必需的氨基酸。该酶底物专一性很强，血纤维蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白质底物，作用于Arg-Val键上，使纤溶酶原转为纤溶酶。

v尿激酶的pI为8～9。溶液状态不稳定。用于治疗各种新血栓形成或血

工艺要点

①收尿：男性尿，8h内处理。调pH6.5以下。

②硅藻土吸附：加入1%的硅藻土，5℃下搅拌吸附1h。

③洗脱：硅藻土吸附物用5℃冷水洗涤后装柱，当洗脱液由清变浑时开始收集。

④除热原、色素：收集液用饱和NaH2PO4，调pH8.0，加NaCl调电导至22M/Ω，过DEAE-SephadexA50层析柱，收集流出活性部分。

⑤CMC浓缩：流出液用1mol/LHAc调至pH4.2，用蒸馏水调电导至16-17M/Ω，通过CMC层析柱。用10倍体积的pH4.2的HAC-NaAc缓冲液洗涤柱床。洗后用0.1%氨水、0.1mol/LNaCl溶液洗脱尿激酶。收集活性组分，杂质被吸附。

⑥产品质量：无色澄清液或白色冻干粉末。酶活力>15000IU/mg蛋白质。 

扩展

v热原（pyrogen）:指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。

v它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。

v这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。

三、人绒毛膜促性激素（HCG）的制备

工艺要点

①吸附粗品：HCl调孕妇尿至pH4-5，加苯甲酸—乙醇饱和液（孕妇尿：苯甲酸乙醇饱和液：乙醇= 1:0.075:5）搅拌1h静置2-3h，过滤，弃滤液，得吸附物。在搅拌下加入95%乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮状沉淀产生，静置过夜，离心，沉淀用95%乙醇和丙酮洗涤，干燥得粗制品。

②提取：加10倍量的4℃1/15mol/L、pH4.8醋酸盐缓冲液，搅拌4h，离心，取上清液。沉淀再提取2h。合并两次提取液，弃去沉淀。

③离子交换层析：CM-Sepharose柱用0.01mol/L的醋酸盐缓冲液平衡后样品上柱。依次用pH4.8、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH5.9、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤出两个峰（杂质）。再用pH8.5、0.2mol/L的醋酸盐缓冲液洗脱，得到的第3峰即为HCG。 

④羟基磷灰石柱层析：柱用pH6.8、0.5mmol/L磷酸盐缓冲液平衡。样品用pH6.8、0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液进行层析上柱。洗脱先用pH6.8、0.5mmol/L再用pH6.8 1.0mmol/L的磷酸盐缓冲液。得到I、II活性峰。然后冷冻干燥。HCG纯品的比活性为10,000-12,000IU/mg蛋白质。

四、白细胞介素-2（IL-2）的制备

（1）性质：由活化的淋巴细胞所产生的，糖蛋白有一个链内二硫桥（58位，105位）。等电点为pH6.5。

（2）工艺路线

工艺要点

①诱生：刺激人外周血白细胞，37℃培养。

②病毒灭活和固液分离：HCl调节pH再用NaOH调，除去变性杂蛋白，收集上清液。

③分级沉淀：加饱和硫酸铵溶液至0.35饱和度，4℃静置24h，离心，弃沉淀，上清中补加固体硫酸铵至0.85饱和度，4℃静置24h，离心，收集沉淀。

④除盐：将沉淀溶于pH6.5、10mmol/L的磷酸钠缓冲液（PBS）中（内含2%（g/100mL）正丁醇,0.15mol/L NaCl）。用pH6.5的10mmol/L PBS透析24h（更换5次透析外液）。收集透析液。 

⑤蓝色琼脂糖层析：透析内液通过Sepharose4B层析柱，用200mL平衡柱缓冲液洗去不吸附蛋白，再用含0.4mol/L NaCl的PBS液洗涤亲和柱，最后用含1.0mol/L NaCl的PBS液解吸IL-2活性组分。

⑥凝胶层析：活性组分经超滤浓缩，上Ultrogel ACA44层析柱，柱用含0.1%聚乙二醇MW6000、2%正丁醇和pH7.6的0.5mol/L甘氨酸的0.2mol/L Tris-HCl洗脱，得IL-2。