一、生物制品原料选择、预处理与保存方法

（1）原料选择

a.原料的选择原则：

①有效成分含量高，新鲜；

②原料来源丰富，产地较近；

③原料中杂质含量少； 

④原料成本低等。

⑤起始原料应质量稳定、可以控制，富含所需目的物。

⑥具手性的起始材料，应制定作为杂质的对映异构体或非对映异构体的限度。

b.原料的选择注意事项：

①植物原料生长的季节性：花（金银花）、皮（春末夏初）叶（光合作用旺盛期、开花前）、果实、全草等。

②微生物原料的对数期；

③动物原料的年龄与性别。

2.原料的预处理：

（1）动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。

（2）植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理。

（3）微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。

3.原料的保存方法：

（1）冷冻法：该方法适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。

（2）有机溶剂脱水法：常用的有机溶剂是丙酮。适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。

（3）防腐蚀保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原料，如发酵液、提取液等。

二、生物制品的提取（extraction）

1.生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。

常用的破碎方法：

①磨切法，属于机械破碎方法，设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。

②压力法，有渗透压法、加压法与减压法三种。

③反复冻融法，设备简便，活性保持好，用时较长。

④超声波振荡破碎法，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。

⑤自溶法或酶解法，用得较少。

2.提取过程

生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质；

①选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。

②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。

③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。

三、分离纯化的基本过程

v生物药物分离纯化一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎 、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。

v流程如下图所示。

生物制品分离纯化的一般流程

包含体：生物大分子、一般在大肠杆菌中积累，致密的聚集在细胞内，一般含50%的重组蛋白、RNA聚合酶。

四、分离纯化的基本技术

v分离纯化是极其重要的一环，由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高；

v基因工程药物是从转化细胞（不是从正常细胞）生产的，对产品的纯度要求高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难。

1.分离纯化技术应满足下列要求

①技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；

②选择性要好，达到较高纯化倍数；

③收率要高；

④要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；

⑤整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。

2.细胞破碎（cell crashing ）

v以大肠杆菌为宿主的药物多为胞内产物，分离需经细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。

（1）细胞收集（cell  collection）：常用离心分离，膜过滤法。

（2）细胞破碎（cell crashing） ：细胞破碎方法有机械破碎法和非机械破碎法。

机械破碎法

v机械破碎法速度快，处理量较大，不会带入其它化学物质；但要产生热量，要采取冷却措施，防止失活。

v现常用方法有：高压匀浆法、超声波破碎法、高速珠磨法、高压挤压法。

      1.高压匀浆器，利用高速造成的剪切、碰撞以及高压到常压的变化，使细胞破碎。

      2.超声波破碎法是小量细胞破碎普遍使用的方法，用声频高于15～20KHz，其破碎机制可能与空化引起的冲击波和剪切力有关。 

3.高速珠磨法设备是珠磨机，原理是细胞悬液与极细的玻璃小球、瓷球、石英砂等研磨剂快速搅拌研磨，利用珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。

4.X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至-25～-30℃形成冰晶，用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。

非机械破碎法

v非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。

v酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、壳多糖酶等。酶溶法必须选择合适的酶，控制好温度、pH和酶用量。

v化学渗透法得用一些有机溶剂（苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂（SDS、Triton）、金属螯合剂（EDTA）、变性剂（脲、盐酸胍）等。

3.固液分离 （solid and liquid isolation）

v分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方法，使细胞碎片分配在一相（通常为下相）而分离，也起部分纯化作用。包括高速离心和超速离心。

v膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等，微滤用于分离细胞、细胞碎片、包含体和蛋白质沉淀物等固体颗粒；超滤用于浓缩蛋白质、多糖和核酸等大分子物质；反渗透用于脱去抗生素、氨基酸等小分子中的水分。

v双水相萃取系统是由两种水溶性高聚物或一种高聚物与无机盐在水溶液中混合而成，常用的双水相系统有聚乙二醇-葡聚糖和聚乙二醇-无机盐。

v聚乙二醇-无机盐应用广泛。聚乙二醇富集的上相一般会有目的产物和其他杂蛋白，下相含有细胞碎片、核酸、多糖等。需要综合考虑聚乙二醇浓度、无机盐浓度、PH等诸多因素。

4.目的产物的分离纯化

v固液分离之后，目的产物仍与大量的杂质混合在一起，这类杂质可能有病毒、热原质、氧化产物、核酸、多聚体、杂蛋白、与目的物类似的异构体等。

v常用到分级沉淀、超滤（0.01-0.2微米的微孔过滤膜）、电泳、色谱等技术。