第三节 免疫细胞功能的检测

测试机体免疫功能，可以通过体外或体内实验对参与免疫应答的不同细胞进行分离、鉴定及功能测定。不同淋巴细胞表面具有特定的表面标志，借此可以对不同的淋巴细胞及其亚群进行鉴定和计数。

一、免疫细胞的分离

体外测定免疫细胞的功能，首先要从外周血或组织中分离所需要的细胞。根据细胞表面标志、理化性质和功能的不同可选择不同的分离方法。

（一）外周血单个核细胞的分离

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验最常用的细胞群，其分离也是分离纯化T、B细胞的首要环节。常用的分离方法是聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Paque）密度梯度离心法。其原理是将葡聚糖和泛影葡胺按适当的比例混合，配置成密度为1.077的分层液（淋巴细胞分离液），将稀释后的抗凝血叠加在分离液上，离心后外周血中各种血细胞的比重不同使不同密度的细胞呈梯度分布（图16-6）。红细胞密度最大，沉至管底，外周血单个核细胞形成不同的层次和细胞区带，最上层是血浆，从而分离出PBMC。

(二)淋巴细胞及其亚群分离

淋巴细胞及其亚群的分离有多种方法，如玻璃黏附法、尼龙棉吸附分离法、E花环分离法等。由于单克隆抗体的应用和免疫学技术的发展，又衍生出许多新的方法。

1．免疫吸附分离法  将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，表达相应细胞表面标志的淋巴细胞被吸附在培养板上，可与悬液中其他细胞分开。

2．免疫磁珠分离法  免疫磁珠法是一种特异性分离所需淋巴细胞的方法。此法是将特异性抗体（如抗CD3、抗CD4或抗CD8等）交联在磁性微珠表面，加入细胞悬液中，具有相应表面标志的细胞与磁珠上的特异性抗体结合。再将细胞悬液置于磁场中，因磁珠被磁场吸引，而将磁珠结合的细胞与未结合磁珠细胞分开，即可获得较高纯度的所需细胞。

3．流式细胞仪分离法  又称荧光激活细胞分选仪分离法（fluorescence activated cellsorting，FACS）。流式细胞仪是一种集光学、流体力学、电力学和计算机技术于一体，可对细胞进行多参数定量测定和综合分析的方法。这些参数包括细胞的大小、核型、表面分子的种类等。基本流程为：先将样品制备成单细胞悬液，与一种或多种荧光素标记抗体反应。细胞悬液经样品孔加入，在压力作用下，细胞排列成单列经喷嘴喷出形成液滴射流，每一液滴中包裹一个细胞。当液滴射流与高速聚焦的激光束相交，液滴中的细胞受激光发光照射，产生散射光并发出各种荧光信号，后者被接收器检测。散射光和荧光信号经计算机收集、处理，进而对细胞特征进行统计和分析。同时，分选部件将所欲分选的细胞液滴赋予电荷，带电液滴在分选器的作用下偏向带相反电荷的偏导板，落入适当容器中，达到分选的目的。

二、免疫细胞功能的测定

检测T、B细胞的数量及功能有助于某些疾病的辅助诊断、疗效观察及科研分析。

（一）T细胞功能测定

1．T细胞增殖试验  特异性抗原或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后，T细胞的代谢和形态发生变化，主要表现为细胞体积增大、胞浆增多、细胞核松散且出现核仁。T细胞的转化过程伴随胞内蛋白质和DNA的合成增加，最终导致细胞分裂。淋巴细胞的增殖反应又称淋巴细胞母细胞转化（lymphoblast transformation）。

体外刺激T细胞转化的丝裂原有PHA、ConA、白喉类毒素、破伤风类毒素、纯蛋白衍生物（PPD）和白色念珠菌等，临床上常用PHA与PBMC共同培养来检测 T细胞的功能，常用的方法有以下三种。

（1）形态学观察法：PHA与PBMC37℃共同培养72h，依据转化为淋巴母细胞的形态特征，在普通光学显微镜下观察并计数转化率。正常人淋巴细胞的转化率为60％～80％。

（2）³H-TdR掺入法：PHA与PBMC共同培养过程中，在终止培养前8～16h加入³H标记的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR），在细胞增殖中，³H-TdR可掺入细胞新合成的DNA中，掺入量与细胞增殖水平成正比。培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的放射活性，可反映细胞增殖水平。

（3）MTT法：MTT化学名为3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑，是一种噻唑盐。在PHA与PBMC共同培养终止前数小时加入MTT。在细胞增殖过程中，MTT可掺入细胞，并作为线粒体内琥珀脱氢酶的底物参与反应，琥珀脱氢酶可将MTT分解为褐色产物，沉积在细胞内或细胞周围。用酶标仪测定培养液中的OD值，可反应细胞增殖水平。本法敏感性虽不及³H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。

2．细胞毒试验  CTL、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作用，可根据待测效应细胞的性质，选用相应的靶细胞检测。常用的为铬释放试验。方法是将受检者外周血分离的PBMC或纯化的CTL细胞与⁵¹Cr标记的靶细胞按一定比例混合，37℃温育后用γ计数器检测上清液中⁵¹Cr的含量。靶细胞被杀得越多，上清液中⁵¹Cr的含量越多，依此推算出杀伤活性的高低。此法可用于测定机体的抗肿瘤免疫功能。

3．皮肤试验  是检测体内T淋巴细胞免疫功能的试验，简便易行。原理是将一定量的特异性抗原皮内注射，48～72h观察结果，若局部出现红肿硬结的直径大于5mm为阳性反应，说明机体对该抗原建立了特异性免疫。细胞免疫功能低下者则成弱阳性或阴性反应。临床上常用来检测某些病原微生物感染、免疫缺陷病、和肿瘤患者的细胞免疫功能。皮肤试验常用的生物性抗原多从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素、链激酶-链道酶、念珠菌素等。

4．T细胞亚群检测  根据T细胞及T细胞亚群表达的分化抗原，分别用鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体与细胞结合，再用荧光素标记的兔抗鼠IgG作为第二抗体，进行间接免疫荧光染色，用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。正常人T细胞数量占外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cell，PBMC）的70％～80％，CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞之和与CD3⁺T细胞一致。在正常人，CD4⁺T细胞与CD8⁺T细胞的比值约为2：1，艾滋病患者的比值则小于1:7。

（二）B细胞功能测定

1．B细胞增殖试验  原理同T细胞增殖试验,但刺激人的B细胞常用的丝裂原为SPA。

2．抗体形成细胞测定  用绵羊红细胞作抗原免疫小鼠后，取小鼠的脾脏细胞、绵羊红细胞、补体与琼脂混合后注入平皿，培养1～3h，观察溶血空斑。空斑形成数即为抗体形成细胞数。

3．血清免疫球蛋白含量测定  免疫球蛋白为B细胞接收抗原刺激后转化为浆细胞分泌的球蛋白，检测血清免疫球蛋白水平可判断B细胞功能。常用指标有血型抗体、IgG、IgM、IgA等。

4．CD抗原检测  B细胞表面抗原有CD19、CD20和CD21等分化抗原，其中有些是全部B细胞所共有，有些仅活化B细胞特有。据此可用相应的单克隆抗体，通过直接免疫荧光法或免疫酶技术加以检测。正常人外周血中CD20⁺ 细胞占淋巴细胞总数的8%～20%。

（三）吞噬细胞功能测定

 将待测巨噬细胞与某种可被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞、金黄色葡萄球菌）混合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。

（四）NK细胞功能的测定

自然杀伤性细胞（nature killer cell，NK cell）是参与固有免疫应答的重要细胞。NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染者，NK活性减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。临床上可采用三色荧光标记单克隆抗体（抗CD3、抗CD16和抗CD56）标记NK细胞，通过流式细胞仪进行分析。健康成人外周血NK细胞占淋巴细胞总数的8%～15%。