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第二节 检测抗原或抗体的体外实验
抗原与相应抗体在体外相遇可发生特异性结合。因此可以利用已知的抗原（或抗体）来检测未知的抗体（或抗原）。由于物理性状的差异或参加反应的其他辅助成分的不同，可出现不同类型的反应。如凝集反应、沉淀反应、中和反应等。由于抗体常存在于血清中，因此习惯上将体外的抗原抗体反应称之为血清学反应（serological reaction）或血清学试验。
（一）凝集反应(agglutinationreaction)
颗粒性抗原（如细菌、红细胞）在一定条件下与相应的抗体特异性结合后，形成肉眼可见的凝集现象称为凝集反应。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应。
1．直接凝集试验（directagglutination reaction） 颗粒性抗原直接与相应的抗体结合出现的凝集现象称为直接凝集试验。常用的方法有玻片法和试管法。玻片法为定性试验，可用于菌种鉴定、分型及人红细胞ABO血型鉴定等。试管法为半定量试验，可以辅助临床诊断及病情分析，如临床上用于诊断伤寒、副伤寒的肥达试验，诊断斑疹伤寒的外斐试验等属此方法。
2．间接凝集试验（indirectagglutination reaction） 将已知可溶性抗原或抗体吸附在与免疫无关的载体颗粒（如活性炭颗粒或胶乳颗粒）表面，形成致敏颗粒，然后与相应的抗体或抗原进行反应出现载体颗粒被动凝集的现象，称为间接凝集试验。
（二）沉淀反应（precipitation reaction）
将可溶性抗原（如血清蛋白、细菌滤液、组织浸出液、毒素）与相应抗体结合后，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中发生。在液体中进行的沉淀反应有环状沉淀反应和絮状沉淀反应。琼脂扩散试验包括单琼脂扩散和双琼脂扩散两种基本方法，将琼脂扩散与电泳技术结合，又衍生出对流电泳和火箭电泳等多种检测方法。
1．免疫比浊法 在一定量抗体中分别加入相应增量的可溶性抗原，抗原抗体结合形成数量不等的免疫复合物，使反应体系呈现不同程度的浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。这种通过浊度仪检测抗原抗体复合物的方法，极大地提高了反应的灵敏度，通过自动化，可同时检测样品中多种分子并进行精确的定量分析。常用于检测前白蛋白、ɑ酸性蛋白酶、转铁蛋白、尿微量蛋白以及IgG、IgM、IgA和补体。此方法快速、简便、取代了传统的环状和絮状沉淀反应，还可替代单向琼脂扩散对抗原含量进行检测。
2．琼脂扩散试验是在琼脂中进行的一种沉淀反应，又称免疫扩散试验。半固体琼脂凝胶作为网状支架，让可溶性抗原、抗体在网间扩散，适当比例的抗原抗体相遇可形成白色沉淀线。依抗原、抗体在一种成分扩散还是两种成分均扩散又分为单向、双向两种类型。如与电泳技术结合，又可衍生出火箭电泳、对流电泳、免疫电泳等多种方法。
（1）单向琼脂扩散（single agar diffusion）：是一种定量试验，敏感性较高，可用来测定血清中IgG、IgM、IgA和补体成分如C3等含量。实验方法如下：将一定量的已知抗体加入已热融化（42～45℃）的琼脂中，混合均匀后制成琼脂板，在适当的位置打孔，将待测抗原加入孔中，置湿盒内使之扩散，如标本中的抗原与琼脂中的抗体相对应，则在比例合适处形成白色沉淀环，沉淀环的直径与抗原含量呈正相关。
（2）双向琼脂扩散（double agar diffusion）：是一种定性试验，如可用来对可溶性抗原和抗体进行检测鉴定。实验方法如下：将琼脂融化制备琼脂板，根据需要在琼脂板上打孔，将抗原与抗体分别加于孔中，置湿盒内使之扩散，若抗原抗体相应比例适当，在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。由于一对相应的抗原抗体结合只能形成一条沉淀线，因此可根据沉淀线的数目推断待测抗原液有多少种抗原成分。
（3）对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis，CIE）：又称免疫电渗电泳，是一种将双向琼脂扩散与电泳技术结合的方法，即在电场作用下进行的双向免疫扩散。可用来检测血清中的HBsAg和甲胎蛋白等可溶性抗原。
（4）火箭电泳(rocketelectrophoresis)：又称电泳免疫扩散，是将单向琼脂扩散与电泳技术结合在一起的定量检测方法。本实验敏感性与单向琼脂扩散相当，但所需时间短，可用来快速测定标本中可溶性抗原的含量。
（三）免疫标记技术
是指用荧光素、同位素、酶等标记抗原或抗体，来检测相应抗体或抗原。此类方法具有高灵敏、特异、快速等优点，能定性、定量和定位检测。目前广泛用于各种微量生物活性物质的鉴定与定量检测。
1．免疫酶技术（immunofluorescencetechnique） 是用酶标记抗体或抗抗体，将酶对底物的高度专一催化作用与抗原抗体反应的高度特异性相结合的检测技术。根据酶催化相应底物的显色反应，对抗原或抗体进行定性、定量或定位分析。酶免疫技术可分为酶免疫组化技术和酶免疫测定两大类。
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是酶免疫测定中应用最为广泛的一种技术。常用双抗体夹心法和竞争法等检测抗原，用间接法检测抗体。①双抗体夹心法：用于检测可溶性抗原。将已知抗体吸附（包被）在固相载体表面；洗涤清除未吸附的抗体后，加入待检标本；如标本中含有相应的抗原，则与包被于固相表面的抗体结合，洗去未结合的成分后，加特异性酶标抗体；再洗涤未结合的酶标抗体后，加底物，酶分解底物可呈现颜色，颜色的深浅代表标本中所含抗原的量。②竞争法：用已知抗体包被在固体载体表面，待检抗原与酶标记抗原同时加入，使二者与固相抗体竞争结合。洗涤除去游离的酶标抗原及其他未结合物后加底物显色。③间接法：用于检测抗原。将已知可溶性抗原包被于固相载体表面；洗涤后加入待测标本；如标本中含有相应的抗体，则与包被于固相表面的抗原结合，形成抗原抗体复合物；洗涤后加酶标记的抗抗体（二抗），使之与待检抗体结合；洗涤后加底物显色。用酶标仪测定底物颜色的深浅，推测抗体的含量。
2．荧光免疫技术（immunofluorescencetechnique） 是用荧光素标记特异性抗体或抗原，检测标本中有无相应抗原或抗体的方法。常用的荧光素有发绿色荧光的异硫氰酸荧光素和发红色荧光的藻红蛋白等。常用的方法有直接法和间接法。①直接法：用荧光素直接标记已知抗体，对固定于玻片的标本进行染色，用缓冲液洗去游离的抗体，干后置荧光显微镜下检查。该法的优点是特异性高；缺点是每检测一种抗原均须制备相应的荧光抗体。②间接法：应用特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧光素标记的抗球蛋白抗体（标记的抗抗体）为第二抗体，当标本中的抗原与已知抗体结合后，再加入荧光素标记的抗球蛋白抗体，洗涤后，置荧光显微镜下观察，通过荧光现象确定待测抗原或抗体的有无。该法优点是敏感性较直接法高，制备一种荧光素标记的第二种抗体即可对多种抗原进行检测，使用较为方便（图16-4）；缺点是非特异性反应增强。免疫荧光技术目前已广泛应用于细菌、螺旋体、病毒性疾病的诊断，还可用于自身免疫性疾病中抗核抗体的检查。
3．放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA) 是用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的技术，将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合，使检测的敏感度达到pg/ml水平。常用于微量物质的测定，如生长激素、胰岛素、地高辛等药物及免疫球蛋白IgE等，但需使用特殊的仪器设备，且有一定的放射性危害。
4．免疫胶体金技术（immunological colloidal gold technique） 是用胶体金标记抗体与组织或细胞标本中的抗原反应，借助显微镜观察颜色分布即可定位、定性测定组织或细胞中的抗原。胶体金技术发展较快，如胶体金半点渗滤试验和胶体金斑点免疫层析试验，尤其是后者检测敏感度高，操作简单，时间短，1～2min即可出现结果，已应用于HCG和乙肝两对半的检测。
5．免疫印迹（immunoblotting） 又称Western印迹法（Westernblotting），本法将高分辨率的凝胶电泳与固相免疫技术相结合，即将通过电泳区分开的蛋白质成分转移至固相载体（硝酸纤维素膜）后，再用酶免疫、放射免疫等技术进行检测的一种方法（图16-5）。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量和抗原特性，具有灵敏性高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布最常用的方法。
